Wei Sun

Департамент иммунологии и микробных заболеваний, Медицинский колледж Олбани, Олбани, Нью-Йорк 12208 США

Амит К. Сингх

Департамент иммунологии и микробных заболеваний, Олбани Медикал Колледж, Олбани, штат Нью-Йорк 12208 США

Департамент иммунологии и микробных заболеваний, Медицинский колледж Олбани, Олбани, штат Нью-Йорк 12208 США

Поступило 23.07.2018 г .; Принято 19 декабря 2018 г.

Abstract

Три великих пандемии чумы, приведшие к гибели почти 200 миллионов человек в истории человечества и использовавшиеся в качестве средства биологической войны, сделали Yersinia pestis одним из самых опасных патогенов человека.В конце 2017 года на Мадагаскаре разразилась крупная вспышка чумы, которая привлекла широкое внимание и вызвала панику в регионе. Превращение местных вспышек в пандемию является проблемой Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC) в эндемичных по чуме регионах. До сих пор нет лицензированной вакцины против чумы. Профилактическая вакцинация против этого заболевания, безусловно, является основным выбором для его долгосрочной профилактики. В этом обзоре мы суммируем последние достижения в области исследований и разработок вакцин против чумы.

Введение

Чума вызывается факультативным внутриклеточным грамотрицательным бактериальным патогеном, Yersinia pestis . Известность чумы как одного из старейших и наиболее печально известных инфекционных заболеваний обусловлена ​​примерно 200 миллионами смертей, которые были зафиксированы на протяжении всей зарегистрированной истории человечества, а также обширными разрушениями, нанесенными обществам, которые впоследствии повлияли на прогресс человеческой цивилизации. ^1,2 В настоящее время чума менее активна, чем другие известные инфекционные заболевания, например.g., СПИД, малярия, грипп, туберкулез, лихорадка денге и некоторые устойчивые к антибиотикам супербактерии (http://www.who.int/news-room/fact-sheets). Однако его роль как серьезной проблемы общественного здравоохранения не следует относить к древности. Сохраняющиеся опасения по поводу будущих вспышек оправданы, поскольку чума сохраняется среди грызунов-хозяев, значительно расширила свой географический ареал, остается эндемичной для многих регионов по всему миру и является причиной нескольких тысяч ежегодных случаев заболевания людей во всем мире. ³ В 2015 году в США было зарегистрировано 15 случаев заболевания людей чумой, в результате которых погибло 4 человека ⁴ , а в конце 2017 года на острове Мадагаскар произошла крупная вспышка чумы, в которой в общей сложности 2348 подтвержденных, вероятных и имели место подозрения на чуму (~ 70% — легочная форма), в том числе 202 случая смерти (летальность 8.6%), ^5–7 разжигая региональную панику. Кроме того, растет озабоченность по поводу множественной устойчивости к антибиотикам Y. pestis ^8–12 из-за внутренней генетической пластичности бактерий. ^13,14 Таким образом, чума признана во всем мире повторно возникающей болезнью. ^15–17

Кроме того, Y. pestis преднамеренно использовалось в качестве биологического оружия, явно зарегистрированного в истории человечества, ^5,6 и считается одним из наиболее вероятных биологических агентов. ^7,8 Во время холодной войны Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) признали аэрозольный Y. pestis мощным биологическим оружием и классифицировали бактерии как отобранный агент первого уровня. ¹⁸ В природе, после укуса инфицированной блохи, млекопитающее-хозяин обычно проявляет инфекцию в бубонной форме и может развить септическую или вторичную легочную инфекцию, если своевременно не лечить. Прямое вдыхание аэрозольной формы Y. pestis может привести к чрезвычайно смертельной форме первичной легочной чумы. ¹ Короткий инкубационный период (1-3 дня) легочной чумы позволяет быстро прогрессировать с высокой летальностью, и исторически жертвы часто становятся источниками вторичных инфекций по мере распространения болезни среди населения. ^1,4

В качестве контрмеры против вышеперечисленных сценариев крайне важно разработать безопасную и эффективную вакцину против чумы. Вакцинация считается эффективной стратегией долгосрочной защиты. Предыдущие обзоры всесторонне обобщили различные виды разработок противочумных вакцин, включая живые рекомбинантные, субъединичные, векторные и другие сформулированные вакцины до 2016 г. (см. Обзоры ^19–32 ).Здесь мы обновляем только самые последние достижения в разработке вакцин (перечисленные в таблице) и оцениваем возможные профилактические и терапевтические вакцины против чумы.

Таблица 1

Оценка вакцины против чумы

Субъединичная вакцина

Многие исследования установили, что белок V с низким уровнем кальциевого ответа (LcrV), многофункциональный белок вирулентности, является незаменимым защитным антигеном против Y.pestis инфекция. ^24,28,33 Исследование вакцин показало, что рекомбинантный LcrV, отдельно или в комбинации с F1, в смешанном коктейльном и гибридном форматах, способен обеспечить превосходную защиту от инфекций бубонной и легочной чумы на различных моделях животных (например, мышей, крыс и т. морская свинка и макаки Cynomolgus). ^34–37 Клинические испытания вакцин субъединиц LcrV и F1 (RypVax ™ и rF1 ^– V) начались около десяти лет назад. ²⁷ RypVax ™ производства PharmAthene Inc.была рекомбинантной вакциной против чумы, содержащей отдельные рекомбинантные антигены F1 (rF1) и V (rV), продуцируемые в Escherichia coli (http://media.corporate-ir.net/media_files/irol/19/1/FactSheet-RypVax-Oct2008 .pdf). Слитая вакцина rF1-V была разработана Медицинским научно-исследовательским институтом инфекционных заболеваний армии США (USAMRIID) ³⁸ и в настоящее время дорабатывается Dynport Vaccine Company, LLC. ²⁷ RV10, усеченный антиген LcrV, разработанный группой Schneewind в 2011 году, в настоящее время проходит предварительную проверку Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) для получения разрешения на проведение будущих исследований фазы I. ²⁷ По сравнению с rF1-V, иммунизация rV10 не выявила существенных различий в эффективности защиты от инфекции легочной чумы у мышей, морских свинок или макак Cynomolgus. Однако вакцины как rF1-V ^39,40 , так и rV10 ³⁴ не смогли защитить африканских зеленых мартышек от легочной чумы так же, как макаки Cynomolgus, несмотря на то, что они вызывали устойчивый ответ антител. Несогласованная эффективность этих субъединичных вакцин у африканских зеленых мартышек и макак Cynomolgus, как предполагалось, связана с дефицитом врожденного или клеточного иммунитета, что приводит к отсутствию эффективного синергетического действия между гуморальным и клеточно-опосредованным иммунным ответом для защиты от легочной чумы. ⁴¹ В последнее время несколько групп пытаются повысить иммуногенность субъединичных вакцин с помощью различных средств.

Домен II белка теплового шока 70 [HSP70 (II)] из Mycobacterium tuberculosis в качестве иммуномодулятора был способен стимулировать эффективные Т-клеточные ответы ⁴² и гибридный белок овальбумин-HSP70 (II) был достаточным для выявления специфического овальбумина. CD8 + цитотоксические Т-лимфоциты. ⁴³ На основании этих выводов группа Тутеи ^44,45 объединила антигены F1 и LcrV Y.pestis с белком HSP70 (II) [F1-LcrV-HSP70 (II)] в качестве вакцины против чумы для усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа. Группа мышей BALB / c, иммунизированных белком F1-LcrV-HSP70 (II), имела значительно повышенный процент CD4 + и CD8 + Т-клеток, продуцирующих IL-2, TNF-α и IFN-γ, по сравнению с группой мышей, иммунизированных с помощью Слитый белок F1-LcrV. Однако иммунизация либо F1-LcrV-HSP (II), либо F1-LcrV обеспечивала полную защиту мышей от внутрибрюшинного (i.p.) заражения 100 LD ₅₀ вирулентного вируса Y.pestis S1 штамм. Возможная причина в том, что более низкая доза i.p. Проба может не дифференцировать защитную эффективность, вносимую клеточным иммунитетом, вызванным F1-LcrV-HSP (II).

Gregg et al. ⁴⁶ сгенерировал мутантный штамм Y. pestis , производный от KIM6 +, Yp Δ msbB pagPYp ^Rep , в котором мутант разрушает вторичную лаурилацилтрансферазу (MsbB) и восстанавливает пальмитаттрансферазу (PagP) Ю. pestis .Мутантный штамм дал структурно отличную молекулу липоолигосахарида (BECC438), которая может вызывать активацию Toll-подобного рецептора 4 (TLR4). Мыши C57BL / 6J, иммунизированные внутримышечно (в / м) rF1-V с адъюватом BECC438 с использованием режима прайм-буста, были полностью защищены от i.p. заражение ∼20 × LD ₅₀ штамма Y. pestis CO92 Δ мкг / м . ⁴⁷

Внутримышечная инъекция Flagellin / F1 / V с увеличением дозы была проведена у здоровых людей в возрасте от 8 до 45 лет в фазе I исследования.В исследование были включены шестьдесят здоровых субъектов; 52% мужчин, 100% неиспаноязычных, 91,7% белых, средний возраст 30,8 лет. Положительные ответы антител наблюдались на F1, V и флагеллин без серьезной реактогенности. ^{48 Группа} Рао разработала рекомбинантную субъединичную вакцину rF1mutV-PA, состоящую из Y. pestis F1 и двойных антигенов LcrV и защитного антигена (PA) Bacillus anthracis с адъювантом Alhydrogel®. ⁴⁹ Трехвалентная вакцина вызвала устойчивые ответы антител у мышей, крыс и кроликов и обеспечила полную защиту мышей и крыс от одновременного интраназального введения (т.е.n.) заражение Y. pestis CO92 и летальная внутривенная (в / в) инъекция токсина B. anthracis . ⁴⁹ F1mutV-PA была первой субъединичной вакциной, демонстрирующей полную защиту от одновременного заражения с заражением Y. pestis и смертельным заражением B. anthracis на различных животных моделях, и продемонстрировала потенциальную профилактическую вакцину для предотвращения биотеррора. атака с использованием оружия B. anthracis и / или Y.pestis . ⁴⁹

VypVaxDuo — новая вакцина, разработанная Moore et al. ⁵⁰ и состоит из рекомбинантных белков F1 и V, смешанных с различными препаратами с использованием подкожного (п / к) режима прайма и перорального бустерного режима. Ранний начальный ответ антител (IgG и IgA) наблюдали через 14 дней после первичной иммунизации и полную защиту от подкожной вакцины. заражение 2 × 10 ⁴ LD ₅₀ Y. pestis CO92 наблюдали после завершения режима у мышей BALB / c.Более того, Мур и соавт. подошли к разработке вакцины с целью создания практического решения для стран с низким и средним уровнем доходов, эндемичных по чуме. В этом отношении VypVaxDuo представляет собой вакцину с сильным потенциалом, поскольку состав первичной вакцины был исключительно стабильным во флаконах в условиях термостресса, что исключает необходимость в холодовой цепи для распределения и хранения. Кроме того, режим прайм-буста требует только одного посещения клиники для подкожного введения. первичная вакцинация, поскольку состав пероральной бустерной вакцины может вводиться самостоятельно и сводит к минимуму потребность в медицинском персонале и вмешательстве.

Новая субъединичная вакцина против чумы, разработанная Liu et al. состоит из нативного F1 и рекомбинантного антигенов V (F1 + rV), абсорбированных адъювантом гидроксида алюминия. Вакцина F1 + rV вызвала очень сильный гуморальный иммунный ответ и низкий уровень клеточно-опосредованного иммунного ответа у яванских макак. ⁵¹ Впоследствии Национальные институты по контролю за продуктами и лекарствами (NIFDC) и провинциальные центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) провинции Цзянсу провели однолетнее исследование иммуногенности и безопасности вакцин, в котором 240 здоровых взрослых в возрасте 18–55 лет были F1 + RV-иммунизировали 15 мкг на 0 день или 20 мкг на 28 день.Результаты показали, что титры анти-F1 и уровни сероконверсии сохранялись на высоком уровне до 12 месяцев, в то время как титры анти-V и уровни сероконверсии резко снижались через 6 месяцев и продолжали снижаться через 12 месяцев. Во время иммунизации серьезных побочных эффектов, связанных с вакциной, не наблюдалось. В целом, клинические испытания на людях показывают, что вакцина субъединицы F1 + rV вызывает устойчивый гуморальный иммунный ответ до 12 месяцев и имеет хороший профиль безопасности для людей. ⁵²

Аттенуированная

Улучшенный штамм рекомбинантной аттенуированной вакцины против Salmonella Typhimurium Vaccine (RASV) , экспрессирующий несколько кодируемых плазмид Y.pestis , включая LcrV196 (аминокислотные остатки 131–326), Psn (рецептор пестизина) и F1, были изучены нашей группой. Синтез нескольких антигенов не оказывал неблагоприятного воздействия на рост бактерий. Мышей BALB / c перорально иммунизировали штаммом RASV, χ12094 (pYA5383). Были получены высокие титры антител, специфичных к rLcrV, Psn и F1. Была предоставлена ​​полная защита от н.в. заражение 5700 КОЕ (~ 570 LD ₅₀ ) Y. pestis CO92 и 60% выживаемость против i.п. заражение 5000 КОЕ (~ 50 LD ₅₀ ) Y. pestis CO92. ⁶⁸ Пероральная иммунизация χ12094 (pYA5383) не вызвала каких-либо смертей или симптомов заболевания у мышей SCID в течение 60-дневного периода. ⁶⁸

Группа Хорвица исследовала мутантный штамм F. tularensis LVS Δ capB и аттенуированный штамм Listeria monocytogenes (Lm) в качестве векторов для доставки множества защитных антигенов от B. anthracis и Y.pestis в качестве новой платформы вакцины для борьбы с тремя отобранными агентами уровня 1: B. anthracis , Y. pestis и F. tularensis . ⁶⁹ Гомологичный прайм-буст с вектором LVS Δ capB или гетерологичный прайм-буст с LVS Δ capB и вакцины с Lm-вектором индуцировали устойчивые антиген-специфические гуморальные иммунные ответы, обеспечивали защитный иммунитет против летального заражения легких с помощью B. anthracis споры Эймса и F.tularensis Schu S4, но обеспечивала только 50% защиту от интраназального заражения 1900 КОЕ Y. pestis CO92 (~ 8 LD ₅₀ ). ⁶⁹ Это исследование предоставило доказательство концепции универсальной вакцины, обеспечивающей защиту от нескольких патогенов 1-го уровня одновременно.

Кроме того, группа Чопры использовала вектор аденовируса человека типа 5 (Ad5) с дефектом репликации для экспрессии оптимизированного по кодонам гена слияния YFV ( ycsF , caf1 и lcrV ).Гетерологичная первичная иммунизация мышей и яванских макак трехвалентной вакциной rAd5-YFV обеспечивала 100% защиту от жесткой контрольной дозы аэрозоля Y. pestis CO92. ⁷⁰ Arnaboldi et al. оценили две различные платформы доставки через слизистые оболочки, живой бактериальный вектор, Lactobacillus plantarum и вектор вируса табачной мозаики (TMV) для интраназального введения антигенов LcrV и F1. ⁷¹ Оба вектора, экспрессирующие LcrV / F1, индуцировали одинаково высокие титры антител IgG и секрецию провоспалительных цитокинов.Однако только TMV-конъюгированные LcrV или F1 защищали от последующего летального заражения Y. pestis . Эти результаты предполагают, что доставка через слизистую оболочку TMV, синтезирующего F1-LcrV, может вызывать полную защиту от летальной легочной инфекции Y. pestis у мышей.

Исследователи из Национального центра здоровья дикой природы Геологической службы США разработали вакцину против сильватической чумы (SPV), состоящую из вируса оспы енотов (RCN), экспрессирующего антигены как F1, так и усеченного белка V (V307), разработанную в качестве вакцины-приманки для защиты луговых собачек. ( Cynomys spp .). ^72,73 Луговые собачки очень восприимчивы к Y. pestis и, как таковые, являются потенциальными источниками передачи чумы людям. ⁷⁴ Совсем недавно полевые испытания показали, что употребление приманок с SPV может защитить луговых собачек от чумы, ^75,76 , что предлагает дополнительный подход к контролю передачи чумы в районах эпидемии.

Везикулы наружной мембраны (OMV) — это везикулы наноразмеров (20–200 нм), выделяемые разнообразным спектром грамотрицательных бактерий и обогащенные белком, полисахаридом и липидными компонентами, включая множество сильнодействующих иммуногенов. ⁷⁷ Сохраняя состав патогенных антигенов на поверхности, OMV вызывают врожденный иммунный ответ, а также запускают адаптивный иммунный ответ. ⁷⁸ Поскольку лицензированная вакцина OMV против Neisseria meningitides оказалась безопасной и защитной для людей, ⁷⁹ OMV в качестве разработки вакцины в последнее время привлекли больше внимания. OMV представляют собой экономически выгодную платформу для вакцины из-за их относительно недорогого приготовления и высокой стабильности.Более того, OMV включают в себя широкий спектр иммуногенов, обеспечивая теоретические преимущества одновременного прайминга иммунитета против многих антигенов и тем самым снижая вероятность обхода антигена. На семинаре ВОЗ по вакцине против чумы в 2018 г. одна исследовательская группа намеревалась использовать Bacteroides OMV для доставки антигена LcrV Y. pestis в качестве нового кандидата на вакцину. По предварительным данным, нечеловеческие приматы (NHP), иммунизированные интраназально LcrV-содержащими OMV, вызвали значительный ответ IgG против LcrV в сыворотке и ответ IgA против LcrV в слюнных железах и бронхоальвеолярной жидкости (BAL). ⁸⁰

Моноклональные антитела в качестве терапевтических вакцин

Только LcrV- или F1-специфические гуморальные иммунные ответы могут быть эффективными для защиты от Y. pestis . ^81,82 Предыдущие исследования показали, что моноклональные антитела (mAb) против LcrV или F1 могут пассивно защищать мышей от заражения чумой. ^83–85 Интратрахеальная доставка аэрозольных LcrV-специфических и F1-специфических моноклональных антител (MAbs 7.3 и F1-04-A-G1) защищала мышей в модели легочной чумы. ⁸⁶ Группа Димитрова идентифицировала одно F1-специфическое человеческое mAb (m252) и два LcrV-специфических человеческих mAb (m253, m254) и продемонстрировала, что m252 обеспечивает лучшую защиту мышей от подкожных инъекций. заражение ∼25-40 LD ₅₀ Y. pestis CO92, чем два других mAb. ⁸⁷ Недавно Liu et al. идентифицировали четыре mAb против F1. Три из mAb (F5C10, F6E5 и F2H5) обеспечивали разные уровни защиты у мышей, которым подкожно заражали 600 КОЕ Y . pestis 141 штамм. Среди прочего, F2H5 обеспечивал полную защиту у мышей Balb / c, которым подкожно заражали Y . pestis 141 штамм. ⁸⁸ В совокупности было бы возможно, что mAb, специфичные к F1 или LcrV, можно было бы использовать в качестве быстродействующего постэкспозиционного лечения людей против инфекции Y. pestis .

Эффективность и безопасность вакцины против чумы. Где отсечка?

Полвека назад США разработали и одобрили убитые формалином целые клетки Y.pestis (USP), которая использовалась для вакцинации военных во время войны во Вьетнаме. ^89,90 Эта вакцина обеспечивала эффективную защиту от бубонной чумы, но вакцина была в высшей степени реактогенной и не обеспечивала долговременной защиты и какой-либо защиты от легочной чумы, ^33,89,91,92 , что ограничивало ее применение против оружейной чумы. легочная чума. RF1-V и RYpVax безопасны и прошли клинические испытания фазы I и II, ^27,36 , но результаты этих испытаний фазы II еще не доступны.В 2017 году FDA присвоило чумной вакцине rF1-V статус орфанных препаратов (https://globalbiodefense.com/2017/03/10/fda-grants-orphan-drug-designation-plague-vaccine/), которая предлагается для маркетинг в 2020 году, который обеспечит эффективную профилактику для лиц с высоким риском контакта с вирулентным вирусом Y. pestis . Однако опасения по поводу неэффективности возникают из-за наличия F1-отрицательных штаммов в естественных резервуарах, которые вызывают смертельные заболевания у мышей и африканских зеленых обезьян. ^93,94 Δ caf1 Y.pestis CO92 был не только полностью вирулентен для мышей при заражении бубонной и легочной чумой, но также превосходил иммунные ответы, полученные от живых ослабленных штаммов или субъединичных вакцин F1. ^95,96 Эндрюс и др. показали, что иммунизация единственным капсульным антигеном F1 обеспечивает значительную защиту от заражения Y. pestis CO92, но не защищает мышей от штамма Y. pestis C12 (штамм F1 ^— ) подкожно. инфекционное заболевание. ^97,98 Batra et al.также показали, что вакцинация только рекомбинантным F1 не защищала мышей от заражения штаммом Y. pestis S1 внутрибрюшинным путем. ⁴⁵ В целом эти результаты снижают надежность антигена F1 как единственной антигенной вакцины, несмотря на существование многих исследований, которые продемонстрировали иммунизацию только антигеном F1, ^97,99 перенос сыворотки против F1, ¹⁰⁰ или Одна доза F1 в составе микрочастиц поли (лактид-гликолид) (PLG) ^101,102 в значительной степени обеспечивала защиту от F1 + Y.pestis проблема.

Кроме того, наличие полиморфизмов lcrV у подвида Y. pestis ¹⁰³ может изменить защитную эффективность вакцин, состоящих только из LcrV и F1, хотя эти вариации в LcrV не повлияли на летальность этих вакцин. штаммы у мышей и их естественных хозяев. Принимая во внимание эту пониженную эффективность, Miller et al. исследовали влияние полиморфизмов в гене lcrV Y. enterocolitica на защитный иммунитет против чумы.Их результаты показали, что поликлональные или моноклональные антитела против LcrV Y. pestis KIM D27 были неспособны блокировать инъекцию типа III Y. pestis , экспрессирующего LcrV ({«тип»: «энрез-нуклеотид», «attrs» : {«text»: «W22703», «term_id»: «1299536», «term_text»: «W22703»}} W22703) из штамма Y. enterocolitica O: 9 {«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «W22703», «term_id»: «1299536», «term_text»: «W22703»}} W22703 или LcrV (WA-314) из штамма O: 8 WA-314. К счастью, результаты показали, что эти штаммы не смогли избежать LcrV-опосредованного защитного иммунитета против чумы в модели внутривенного заражения. ¹⁰⁴ Таким образом, была протестирована комбинация нескольких антигенов для предотвращения этого риска. ^68,70,105 Исследования показали, что эффективность вакцины может отличаться при измерении защиты от бубонной или легочной чумы. Скошенные по Th2 и Th27 иммунные ответы от вакцин обеспечивают лучшую защиту от легочной инфекции Y. pestis , чем ответы со смещением по Th3 от субъединичной вакцины. ^106–111 Следовательно, составы вакцин, в которых используются различные адъюванты, искажающие Th2 и Th27, такие как MPLA ¹¹² или CAF01 ^50,113 , потенциально могут обеспечить более высокую защиту.

Живая аттенуированная вакцина Y. pestis серии EV, произведенная в 1920-х годах, была введена миллионам людей на Мадагаскаре, Индонезии, Вьетнаме и Советском Союзе. ^114,115 Первичная однократная вакцинация живой вакциной EV NIIEG была способна вызвать иммунный ответ против бубонной и, в некоторой степени, легочной чумы, который длился один год. ^{25 116} Теоретически серия живых вакцин EV намного лучше, чем убитая вакцина. Однако живые вакцины были в некоторой степени патогенными для нечеловеческих приматов и реактогенностью для людей, ^91,117–119 сохраняли вирулентность при интраназальном введении (т.е.п.) и внутривенно (в / в) ^107,118,120 или лицам с гемохроматозом. ¹²¹ Отсутствие прозрачных данных о защите и безопасности при предыдущей крупномасштабной иммунизации людей, а также отсутствие генетической однородности вакцинного штамма из-за множества пассажей, ¹¹⁸ помешали серии вакцин EV получить всемирное признание, особенно в США и Европе. ⁸⁹ По мере продолжения исследовательских усилий по созданию живых аттенуированных вакцинных штаммов Y. pestis со специфически определенными мутациями, так же будет достигнута цель достижения баланса между безопасностью и защитной эффективностью.Более того, рациональное изменение живых аттенуированных вакцинных штаммов Y. pestis для индукции как гуморальных, так и клеточно-опосредованных иммунных ответов на несколько антигенов Y. pestis теоретически обеспечит более сильную защиту, чем вакцины, основанные на комбинации нескольких антигенов. .

Недавно ВОЗ на семинаре ВОЗ по чумной вакцине в 2018 г. разработала концепцию профиля целевого продукта противочумной вакцины. на основе адъюванта), на основе бактериального вектора (например,g., OMV-доставлен, Salmonella, -экспрессирован), вирусный вектор (например, на основе Ad5, на основе Чада), E. coli, T4 бактериофаг, и живой аттенуированный (например, Y. pseudotuberculosis или Y. pestis ) вакцины, экспрессирующие один или несколько первичных антигенов Y. pestis (например, антиген капсульного белка F1, антиген LcrV, антиген YscF и / или пестицинкоагулаза), которые были протестированы. в различных моделях животных. Два из этих кандидатов завершили клинические испытания фазы 2 и продвигаются к лицензированию FDA, а несколько кандидатов планируют начать клинические испытания в 2019 году.

Требования и соображения TPP ⁸⁰ ВОЗ для профилактической вакцины против чумы включают в себя выявление длительного иммунитета и возможное применение у населения, проживающего в эндемичных районах, или медицинских работников, участвующих в расследовании или надзоре вспышки чумы. Требования и соображения в отношении терапевтической вакцины включают в себя выработку быстрого защитного иммунитета после первой дозы в узком окне и защиту людей в зонах вспышки для блокирования цепочек передачи.Механизмы защитного иммунитета сложны и различаются в зависимости от дизайна вакцины и пути введения, в дополнение к вариациям иммунного ответа, вызванного внутренними свойствами различных вакцин-кандидатов. Многие недавние исследования показали, что гетерологичная иммунизация с первичной бустом потенциально может быть более иммуногенной, чем гомологичная иммунизация с первичной бустом. ^70,122–125 Таким образом, комбинации различных форм вакцины с использованием стратегии гетерологичной повторной праймерной вакцинации, такой как субъединичная вакцина с живой аттенуированной вакциной Y.pestis или вакцина против чумы с живым вектором, могут преодолеть существующие ограничения противочумных вакцин и эффективно предотвратить потенциальную вспышку чумы.

Благодарности

Мы благодарим г-жу Ясмин Карма за редактирование языка. Эта работа была поддержана грантами AI125623 Национального института здоровья WS и стартовым фондом Медицинского колледжа Олбани.

Вклад авторов

Рукопись написана Вэй Сун и Амитом К. Сингхом. Каждый автор внес свой вклад, просмотрел и одобрил эту рукопись.

Примечания

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Сноски

Примечание издателя: Springer Nature сохраняет нейтралитет в отношении юрисдикционных претензий в опубликованных картах и ​​о принадлежности организаций.

Ссылки

80. W.HO Workshop. Испытания эффективности вакцин против чумы: конечные точки, дизайн испытаний, выбор места проведения. (2018).

114. Демер, К.in Yersinia: Systems Biology and Control (ред. Э. Карниэль и Б. Дж. Хиннебуш) 123–142 (Caister Academic Press, Wymondham, 2012).

115. Уильямсон, Э. Д. и Ойстон, П. С. Ф. в Йерсиния: Системная биология и контроль . (ред. Э. Карниэль и Б. Дж. Хиннебуш) 143–168 (Caister Academic Press, Wymondham, 2012).

3 новых вакцины против бактерий чумы «черная смерть». Обещание

Чума — это древняя болезнь, которая может быть смертельной сегодня, но теперь исследователи разрабатывают новые вакцины, которые потенциально могут защитить от чумной инфекции, как показывают первые исследования на животных.

В новом исследовании исследователи протестировали три вакцины, которые были разработаны для защиты людей от инфекции, вызываемой бактериями, вызывающими чуму, известными как Yersinia pestis . Чтобы создать вакцину, исследователи модифицировали несколько генов бактерий, чтобы они не могли вызывать заболевание, но, вероятно, вызывали иммунный ответ у животного. В частности, вакцины были разработаны для защиты людей от бактерий, вызывающих легочную чуму, наиболее серьезную форму чумы и единственный вид, передающийся воздушно-капельным путем.

Мышам и крысам вводили по две дозы каждой из трех вакцин. Затем исследователи заразили животных легочной чумой в течение четырех месяцев (120 дней) после вакцинации. В различных экспериментах от 80 до 100 процентов вакцинированных животных пережили чуму.

«Очень важно, чтобы потенциальная вакцина… [против чумы] демонстрировала долгосрочные иммунные ответы и защиту», — написали исследователи в выпуске журнала npj Vaccines от 13 октября.По их словам, новое исследование показало, что все три вакцины стимулировали иммунный ответ у животных, который был способен защитить их от развития легочной чумы. [Фотографии убийцы: Галерея чумы]

Хотя вакцины против чумы были разработаны в прошлом, в настоящее время нет вакцины против чумы, одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США. Ранее существовала вакцина, защищающая от бубонной чумы (другой формы чумы, вызывающей увеличение лимфатических узлов, называемых бубонами), но эта более старая вакцина не предотвращала легочную чуму и, согласно информации о вакцине от U.С. Военно-морской флот.

Чума наиболее известна тем, что убила миллионы людей в Европе в 1300-х годах во время пандемии, названной «Черная смерть». По данным Центров по контролю и профилактике заболеваний, сегодня в Соединенных Штатах ежегодно регистрируется в среднем семь случаев чумы среди людей. Чуму можно вылечить антибиотиками, если начать прием лекарств вскоре после заражения.

Но без своевременного лечения чума почти на 100% смертельна, говорят исследователи.

Из-за высокого уровня смертности без лечения «оптимальной стратегией защиты людей … от этой смертельной болезни была бы вакцинация», — сказал Ашок Чопра, профессор микробиологии и иммунологии в Медицинском отделении Техасского университета в Галвестоне. заявление.Правительственные чиновники также обеспокоены тем, что бактерии чумы могут быть использованы в качестве биологического оружия.

Исследователи планируют провести больше исследований на животных, чтобы проверить безопасность своих вакцин, а также лучше понять, каким образом вакцины защищают от чумы. В конце концов, исследователи планируют проверить эффективность вакцин на нечеловеческих приматах (например, обезьянах), что является важным шагом в тестировании вакцин перед их использованием на людях.

Оригинальная статья о Live Science .

Пирбрайт раскрывает истинную стоимость кампаний вакцинации от чумы коз

Исследование, проведенное Институтом Пирбрайта, создало первую схему для определения истинной стоимости кампаний вакцинации против чумы мелких жвачных животных (ЧМЖ) на основе тематических исследований в Эфиопии. ЧМЖ, также известная как козья чума, представляет собой заразное вирусное заболевание овец и коз, которое оказывает серьезное социально-экономическое воздействие на фермеров с пораженными стадами в больших частях Африки и Азии. Новый подход к оценке затрат важен для Глобальной стратегии борьбы и искоренения, запущенной Продовольственной и сельскохозяйственной организацией (ФАО) и Всемирной организацией здравоохранения животных (МЭБ).

Доктор Ник Лайонс, ведущий автор и научный сотрудник Pirbright, сказал: «Многие системы, которые оценивают стоимость стратегий борьбы с болезнями, учитывают лишь небольшую часть затрат фермеров, тогда как на самом деле существует гораздо больше переменных, которые следует учитывать. Например, предыдущие оценки затрат на вакцинацию могут учитывать только стоимость вакцины и ветеринарного лечения, но не другие факторы, такие как транспорт, поездки и маркетинг. Это исследование помогает нам оценить, сколько вакцины в реальном выражении обходятся фермерам, и выявляет препятствия на пути внедрения вакцины ».

Используя новую схему, команда обнаружила, что общая стоимость каждой дозы вакцины была примерно в 2,5 раза дороже, чем предполагалось ранее, в среднем 0,15 доллара США за дозу. Они также обнаружили, что общая стоимость вакцинации варьируется в зависимости от типа фермерской системы. Фермеры, которые занимались смешанным животноводством и растениеводством, фактически платили вдвое дороже за каждую дозу вакцины по сравнению с фермерами, которые разводили только домашний скот. Кроме того, серьезной проблемой был признан расход вакцины из-за пропущенных прививок, который в некоторых случаях достигал 33%.

Чтобы разработать свою схему, исследователи проследили за четырьмя кампаниями вакцинации против ЧМЖ в Эфиопии, чтобы понять их финансовые последствия на местном уровне. Команда приняла во внимание практические затраты, такие как стоимость дозы вакцины, транспортировка и хранение вакцины, а также введение вакцины на местах. Они также проанализировали более абстрактные затраты, такие как стоимость времени фермера на посещение вакцинации, координация кампании вакцинации, затраты на рекламу и мобилизацию, а также потери вакцины.

Выявление этих «невидимых» затрат позволило получить более точную оценку стоимости вакцины для фермеров и указать, что может повлиять на их готовность участвовать в кампаниях. Эта новая информация может оказать важное влияние на национальные и глобальные оценки затрат на вакцинацию против ЧМЖ и помочь сделать новые и существующие стратегии более эффективными. Однако сама структура не ограничивается PPR; методы, описанные в Профилактической ветеринарной медицине, могут применяться в кампаниях вакцинации от множественных инфекционных болезней сельскохозяйственных животных во многих странах.

«Вакцинация является основным компонентом борьбы с болезнями, но, в отличие от человеческих болезней, оценка стоимости вакцины для домашнего скота затруднена из-за отсутствия надежной информации и поэтому почти всегда основывается на предположениях, а не на реальных полевых данных, собранных поддающимся проверке и объективным образом. », — сказал доктор Лайонс. «Мы надеемся, что моделирование этой системы на основе данных, собранных в Эфиопии, сделает будущие оценки кампаний вакцинации домашнего скота более надежными, чтобы мы могли работать над сокращением затрат и повышением эффективности, что в конечном итоге приведет к более эффективной профилактике заболеваний.”

Это важное исследование было проведено учеными из Пирбрайта, офиса ФАО в Эфиопии, Университета Гондар в Эфиопии и Института инфекций и глобального здравоохранения Ливерпульского университета при поддержке GALVmed при финансовой поддержке Билла и Мелинды Гейтс. Фонд и правительство Великобритании.

Вакцины

Вакцина против сильватической чумы

Полевые испытания эффективности вакцины против сильватической чумы

Более 30 организаций и агентств тестируют оральную вакцину, разработанную USGS, для предотвращения распространения чумы среди луговых собачек.В случае успеха вакцина против лесной чумы может помочь защитить черноногих хорьков, находящихся под угрозой исчезновения, на западе США, потому что хорьки полагаются на луговых собачек в качестве пищи.

Вакцину помещают в приманку со вкусом арахисового масла (на фото), которая затем разбрасывается по тестовым участкам для потребления луговыми собачками. (Источник: Тони Рок, Геологическая служба США. Общественное достояние.)

Чума, вызываемая Yersinia pestis , широко распространена на западе США и часто встречается у диких грызунов.Все четыре вида луговых собачек в США особенно восприимчивы к чуме, страдая от высоких показателей смертности во время вспышек (> 90%), что приводит к местным искоренениям. Как ключевой вид пастбищных экосистем, потери луговых собачек существенно влияют на множество других видов, которые зависят от них в плане пропитания или укрытия, в том числе черноногих хорьков, роющих сов, горных ржанок и некоторых хищных собак и птиц. В настоящее время с чумой луговых собачек справляются путем ручного нанесения инсектицидов в норы, чтобы убить блох, передающих Y.pestis . Однако этот процесс трудоемок, и недавние данные свидетельствуют о том, что у блох может развиться устойчивость к наиболее часто используемым пестицидам.

NWHC совместно с другими разработал и протестировал вакцину против лесной чумы (SPV), которую можно доставлять луговым собачкам с помощью аппетитной наживки, которая предлагает дополнительный подход к борьбе с чумой. С 2013 по 2015 год NWHC провел большое совместное полевое исследование, чтобы проверить эффективность SPV в снижении смертности от чумы у четырех видов луговых собачек в 7 западных штатах.В этом исследовании участвовали государственные, федеральные, племенные и негосударственные учреждения, организованные в рамках Группы реализации мер по восстановлению черноногих хорьков (BFFRIT), межведомственной инициативы, возглавляемой Службой охраны рыбных ресурсов и дикой природы США. Вакцинация оказала в целом положительный эффект на численность луговых собачек на наших участках исследования по сравнению с участками плацебо, а также увеличила выживаемость луговых собачек на участках, где была обнаружена чума. Хотя на участках вакцинации произошли некоторые потери чумы, наши результаты свидетельствуют о том, что потребление насыщенных вакциной приманок может защитить луговых собачек от чумы.Однако необходимы дальнейшая оценка и уточнение, чтобы оптимизировать использование SPV в качестве инструмента управления и определить, принесет ли его использование пользу другим видам, таким как черноногие хорьки, или же его можно использовать для защиты здоровья населения.

Применение вакцины против сильватической чумы для сохранения и общественного здравоохранения на территориях обслуживания национальных парков

Луговая собачка Ганнисона ест наживку с вакциной против лесной чумы. В дикой природе луговые собачки с меньшей вероятностью погибнут от чумы после того, как они проглотят приманку со вкусом арахисового масла, содержащую вакцину против этой болезни.(Источник: Тони Рок, Геологическая служба США. Общественное достояние.)

Чума, вызванная Yersinia pestis , на протяжении всей истории уничтожала популяции людей и животных. В Соединенных Штатах ежегодно регистрируется 5-10 случаев чумы среди людей, включая несколько смертельных случаев. Болезнь также смертельна для черноногих хорьков, находящихся под угрозой исчезновения, которые считаются одними из самых редких млекопитающих в Северной Америке, и их добычи — луговых собачек. Реинтродукция черноногих хорьков произошла в национальном парке Бэдлендс в рамках национальных усилий по восстановлению.Несмотря на первоначальные успехи, чума считается самым большим препятствием на пути к полному выздоровлению черноногого хорька.

Текущие усилия по борьбе с чумой у хорьков являются трудоемкими и включают отлов и вакцинацию выпущенных хорьков и обработку пестицидами нор луговых собачек для уменьшения количества блох, переносящих Y. pestis . Однако в некоторых местах у блох развивается устойчивость к пестицидам. Поэтому NWHC изучает эффективность вакцины против лесной чумы для защиты не только популяций луговых собачек, но и хорьков, добыча которых зависит от этих популяций.

Вакцина против синдрома белого носа

Проверка возможности вакцинации от синдрома белого носа и других болезней летучих мышей

Летучие мыши важны для защиты здоровья человека и экономики США, поскольку они контролируют насекомых, которые являются переносчиками болезней (например, вирусы Западного Нила и Зика) или наносят ущерб сельскохозяйственным культурам (по оценкам, экономия составляет 3,5 миллиарда долларов ежегодно).К сожалению, североамериканские летучие мыши переживают сокрушительное сокращение популяции из-за нового грибкового заболевания — синдрома белого носа (WNS).

Маленькая коричневая летучая мышь с синдромом белого носа (Источник: Марвин Мориарти, Служба охраны рыболовства и дикой природы США. Общественное достояние).

Чтобы помочь защитить популяции летучих мышей в Северной Америке, NWHC разрабатывает вакцину против грибка, вызывающего WNS, который можно применять местно к диким летучим мышам. В настоящее время проходят испытания несколько вакцин-кандидатов, чтобы определить, какая из них лучше всего защищает зимующих летучих мышей.После разработки цель состоит в том, чтобы придать устойчивость к болезням уязвимым летучим мышам и защитить их популяции. Этот проект был запрошен Службой рыболовства и дикой природы США и совместно финансируется USFWS, миссией USGS Ecosystems Mission Area и Национальным фондом рыбы и дикой природы (NFWF).

Изучение возможностей трансдермальной иммунизации летучих мышей

Служба охраны рыбных ресурсов и диких животных США, а также многочисленные государственные учреждения и природоохранные организации обратились за помощью в определении и реализации стратегий по сохранению популяции летучих мышей, подверженных риску.Поэтому NWHC тестирует и разрабатывает новые методы вакцинации (трансдермальной — через кожу) против грибка, вызывающего WNS. Этот проект финансируется Циклической программой болезней дикой природы «Экосистемы» и осуществляется в сотрудничестве со Школой ветеринарной медицины Университета Висконсина.

Проектная документация

Вакцина против бешенства

Летучие мыши в вечернем небе Техаса. (Фото: Пол Крайан, Геологическая служба США. Общественное достояние.)

Оральная доставка вакцины для борьбы с бешенством у летучих мышей-вампиров ( Desmodus rotundus )

Бешенство, передаваемое летучими мышами-вампирами скоту или людям, является огромным экономическим бременем в странах Центральной и Южной Америки.Кроме того, летучие мыши-вампиры движутся на север и, как ожидается, в следующем десятилетии рассредоточатся в южном Техасе. В настоящее время менеджеры уничтожают летучих мышей-вампиров, чтобы уменьшить популяцию переносчиков, путем нанесения пестицидов на кожу пойманных летучих мышей. Поэтому NWHC разрабатывает эффективную и практичную оральную вакцину от бешенства, которую можно наносить на кожу летучих мышей-вампиров. Для достижения этой цели необходимы лабораторные контрольные испытания на летучих мышах-вампирах для подтверждения эффективности вакцины, а также необходимо разработать и протестировать средство доставки вакцины посредством полевых испытаний.Предполагаемая цель этого проекта — найти более эффективные способы борьбы с бешенством у летучих мышей, снижая риски для людей и домашних животных. Эта работа ведется в тесном сотрудничестве с USDA-APHIS в Мексике.

Сильватическая чума

Чума широко распространена на западе США и часто встречается у диких грызунов. Все четыре вида луговых собачек в США особенно восприимчивы к чуме, страдая от высоких показателей смертности во время вспышек (> 90%), что приводит к местному искоренению и сокращению популяции.Как ключевой вид пастбищных экосистем, утрата луговых собачек значительно влияет на множество других видов, которые зависят от них в плане пропитания или укрытия, включая находящихся под угрозой исчезновения черноногих хорьков, роющих сов, горных ржанок и некоторых хищников-собак и птиц. Борьба с чумой является жизненно важной задачей для текущих усилий по управлению и сохранению луговых собачек и черноногих хорьков.

Луговая собачка Ганнисона ест наживку с вакциной против лесной чумы. В дикой природе луговые собачки с меньшей вероятностью погибнут от чумы после того, как они проглотят приманку со вкусом арахисового масла, содержащую вакцину против этой болезни.

(Источник: Тони Рок, Геологическая служба США. Общественное достояние)

В настоящее время с чумой луговых собачек борются путем ручного нанесения инсектицидов в норы для уничтожения блох, которые являются переносчиками Y. pestis. Однако этот процесс трудоемок, и недавние данные свидетельствуют о том, что у блох может развиться устойчивость к наиболее часто используемым пестицидам.

Национальный центр здоровья дикой природы (NWHC) USGS совместно с другими разработал и испытал вакцину против лесной чумы (SPV), которую можно доставлять луговым собачкам через приятную на вкус приманку, которая предлагает дополнительный подход к борьбе с чумой.С 2013 по 2015 годы ученые NWHC провели большое совместное полевое исследование, чтобы проверить эффективность SPV в снижении смертности от чумы у четырех видов луговых собачек в 7 западных штатах. В этом исследовании участвовали государственные, федеральные, племенные и негосударственные учреждения, организованные в рамках Группы реализации мер по восстановлению черноногих хорьков (BFFRIT), межведомственной инициативы, возглавляемой Службой охраны рыбных ресурсов и дикой природы США. Исследование показало, что вакцинация увеличивает численность луговых собачек, а также увеличивает выживаемость в местах вспышек чумы.Тем не менее, необходимы постоянные исследования для расширения использования SPV в качестве инструмента управления и определения того, принесет ли его использование пользу другим видам, таким как черноногие хорьки, или его можно использовать для защиты здоровья населения. Узнайте больше о работе NWHC над вакцинами.

Дополнительные ресурсы вакцины против сильватической чумы

Полная защита от легочной и бубонной чумы после однократной пероральной вакцинации

Абстрактные

Фон

В настоящее время эффективной вакцины против чумы нет.Ранее мы показали, что генетически аттенуированная Yersinia pseudotuberculosis , продуцирующая антиген Yersinia pestis F1, была эффективной живой пероральной вакциной против легочной чумы. Однако эта кандидатная вакцина не смогла обеспечить полную защиту от бубонной чумы и не вырабатывала стабильно F1.

Методология / основные выводы

Оперон caf , кодирующий F1, был вставлен в хромосому генетически аттенуированного Y . pseudotuberculosis , дающий штамм VTnF1, который стабильно продуцировал капсулу F1. При пероральном введении мышам VTnF1 сохранялся две недели в кишечнике мышей и индуцировал высокий гуморальный ответ, направленный как на F1, так и на другие Y . pestis антигенов. Вызванный сильный клеточный ответ был направлен в основном против мишеней, отличных от F1, но также и против F1. В нем участвовали клетки с эффекторным профилем Th2-Th27, продуцирующие IFNγ, IL-17 и IL-10. Однократная пероральная доза (10 ⁸ КОЕ) VTnF1 обеспечивала 100% защиту от легочной чумы с использованием высокой дозы заражения (3300 LD ₅₀ ), вызванной полностью вирулентным Y . pestis CO92. Более того, вакцинация защищала 100% мышей от бубонной чумы, вызванной заражением 100 LD ₅₀ Y . pestis и 93% против высокодозной инфекции (10 000 LD ₅₀ ). В защите задействованы быстродействующие механизмы управления Y . pestis распространились из места инъекции, и обеспечиваемая защита была длительной: через шесть месяцев после вакцинации 93% и 50% мышей пережили бубонную и легочную чуму соответственно.Вакцинированные мыши также пережили бубонную и легочную чуму, вызванную высокой дозой неинкапсулированного (F1 ^— ) Y . pestis .

Значение

VTnF1 — это простая в производстве, генетически стабильная вакцина против чумы, обеспечивающая высокоэффективную и длительную защиту как от бубонной, так и от легочной чумы, вызываемой диким типом или неинкапсулированной (F1-отрицательной) Y . pestis . Насколько нам известно, VTnF1 — единственная вакцина против чумы, о которой когда-либо сообщалось, которая может обеспечить высокую и длительную защиту от двух форм чумы после однократного перорального введения.

Сведения об авторе

Yersinia pestis , возбудитель чумы, является одним из самых смертоносных инфекционных агентов, поражающих людей. Введен в кожу инфицированными блохами, Y . pestis вызывает бубонную чуму, которая иногда перерастает в смертельную и заразную легочную чуму. Г . pestis также является опасным потенциальным биологическим оружием, но вакцины против чумы нет. В текущем исследовании описывается разработка вакцины, высокоэффективной против чумы как в ее бубонной, так и в легочной формах.Стратегия состоит из живого, авирулентного, генетически модифицированного Yersinia pseudotuberculosis , который продуцирует капсульный антиген Y . pestis , названный F1. Цель состояла в том, чтобы предложить вакцину, которую можно было бы легко производить быстро в больших количествах с высоким качеством и легко вводить людям с помощью однократной пероральной дозы. Описанный штамм VTnF1 удовлетворяет этим требованиям. Генерируемый иммунный ответ является длительным и включает как антитела, так и клетки памяти, направленные против F1 и других антигенов.Мы пришли к выводу, что VTnF1 — очень многообещающая кандидатная вакцина против чумы.

Образец цитирования: Derbise A, Hanada Y, Khalifé M, Carniel E, Demeure CE (2015) Полная защита от легочной и бубонной чумы после однократной оральной вакцинации. PLoS Negl Trop Dis 9 (10): e0004162. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162

Редактор: Майкл Каппелло, Йельский центр исследования здоровья детей, США

Поступила: 5 мая 2015 г .; Принята к печати: 22 сентября 2015 г .; Опубликован: 16 октября 2015 г.

Авторские права: © 2015 Derbise et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах документ и вспомогательные информационные файлы к нему.

Финансирование: Авторы не получали специального финансирования на эту работу.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Чума была одной из самых смертоносных бактериальных инфекций в истории человечества, вызвавшей миллионы смертей во время трех крупных исторических пандемий и оставив неизгладимый след в коллективной памяти человека. Помимо древних очагов болезни в Азии и Африке, последняя пандемия (чума современности), начавшаяся столетие назад, позволила чуме развить новые очаги на ранее не пораженных территориях, таких как Мадагаскар, Южная Африка и Америка.Несмотря на значительный прогресс в ее профилактике и лечении в 20-м веке, чума недавно вернулась снова, вызвав около 50 000 случаев заболевания людей за последние 20 лет [1], включая случаи в странах, где считалось, что чума исчезла [2]. . Поэтому чума классифицируется ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) как повторно возникающее заболевание [1, 3].

Этиологический возбудитель чумы, Yersinia pestis , является высокопатогенной грамотрицательной палочкой, совсем недавно полученной от гораздо менее вирулентного энтеропатогена Yersinia pseudotuberculosis [4].Передача чумной палочки человеку обычно начинается с укуса инфицированной блохи, вызывающей бубонную чуму — наиболее частую клиническую форму заболевания. Г . pestis иногда попадает в дыхательные пути, и возникающая вторичная легочная чума очень заразна из-за выброса инфицированных аэрозолей, вызывающих передачу легочной чумы между людьми. При отсутствии лечения эта пневмопатия обычно приводит к летальному исходу менее чем через три дня.

Возможное использование бациллы чумы в качестве биотеррористического оружия также представляет серьезную угрозу из-за ее патогенности и передачи от человека к человеку. Г . pestis был классифицирован Центрами по контролю за заболеваниями (CDC) США среди избранных биологических агентов Уровня 1. Различные штаммы Y . pestis , демонстрирующие устойчивость к антибиотикам, которые в настоящее время используются для лечения пациентов, были обнаружены на Мадагаскаре [5]. Следовательно, антибиотикотерапия уже не может считаться достаточной против естественной и преднамеренной опасности чумы.Столкнувшись с таким риском для здоровья населения, вакцины могут быть одной из единственных оставшихся альтернатив для ограничения числа смертей среди людей. Вакцина против чумы должна обеспечивать защиту от бубонной чумы, наиболее частой формы болезни в природе [1], являющейся источником вспышек легочной чумы. Вакцина также должна защищать от легочной чумы, наиболее заразной и смертельной формы болезни.

В настоящее время вакцина против чумы не лицензирована. Живой аттенюированный Y . pestis Штамм EV76 и его производные ранее использовались на людях [6, 7], и было обнаружено, что они обеспечивают защиту.Однако генетическая нестабильность Y . pestis представляет собой серьезное препятствие для использования в качестве живой вакцины [4, 8]. Недавно было разработано несколько молекулярных вакцин-кандидатов, среди которых две молекулярные вакцины (RypVax ^TM и rF1V ^TM ) являются наиболее продвинутыми в клинических испытаниях [9, 10]. Эти вакцины основаны на комбинации двух пептидов: антигена F1, составляющего Y . pestis и компонент LcrV системы секреции третьего типа (TTSS) [9, 10], которые являются эффективными мишенями защитного иммунитета против чумы [6, 11].Молекулярные вакцины обычно имеют адъювант с квасцами и, таким образом, являются хорошими индукторами продукции антител, но плохими индукторами клеточного иммунного ответа [12, 13]. Однако клеточный иммунитет важен для защиты от чумы [14], и слабый клеточный ответ может объяснить, почему африканские зеленые обезьяны, вакцинированные F1-V, были плохо защищены, несмотря на адекватные титры антител [15].

Недавно мы предложили вакцину против чумы, основанную на оральной вакцинации живым аттенуированным штаммом Y . псевдотуберкулез [16, 17]. Потому что этот вид является недавним предком Y . pestis , оба вида генетически почти идентичны, тогда как Y . Псевдотуберкулез имеет гораздо более низкую патогенность и гораздо более высокую геномную стабильность [4]. Из-за своей иммуногенности и антигенной сложности живые вакцины генерируют как гуморальные, так и клеточно-опосредованные иммунные ответы без добавления адъюванта, и ответ направлен против нескольких антигенов-мишеней, вызывая, таким образом, иммунологический ответ, который невозможно обойти с помощью генной инженерии Y . pestis . Кроме того, живая вакцина, однажды разработанная и утвержденная, может легко и быстро поступить в массовое производство и будет хорошо приспособлена для реагирования на чрезвычайные ситуации. В качестве доказательства концепции мы сообщили, что оральная инокуляция двух доз живого, естественно аттенуированного Y . Псевдотуберкулез может обеспечить 88% защиту от бубонной чумы [16].

Начальный Y . pseudotuberculosis Штамм , который мы исследовали, не был генетически определен [16].Для разработки вакцины как авирулентного, так и генетически определенного вирулентного штамма Y . pseudotuberculosis Штамм IP32953, геном которого известен [4], был необратимо аттенуирован путем делеции генов, кодирующих три основных фактора вирулентности (остров высокой патогенности, YopK, и антиген pH6 (PsaA [17]). Было сконструировано инкапсулированное производное F1, которое было получено путем клонирования оперона Y , pestis F1, кодирующего caf , в плазмиду, и введения этой плазмиды в ослабленную V674 Y . pseudotuberculosis , таким образом продуцируя штамм V674pF1. Оральная вакцинация с использованием 10 ⁸ КОЕ на 100% защищала от легочной чумы, вызванной заражением 33 LD ₅₀ Y . pestis и 80% против заражения высокой дозой (3300 LD ₅₀ ) [17]. Однако впоследствии мы обнаружили, что вакцинация штаммом V674pF1 защищает только 81% мышей от бубонной чумы, вызванной подкожной инъекцией умеренной дозы (100 LD ₅₀ ) Y . pestis , уровень защиты признан недостаточным. Мы также наблюдали, что продукция F1 не была стабильной и гомогенной в вакцинном штамме V674pF1, что, возможно, объясняет предоставленную неполную защиту.

Целью этого исследования было создание нового вакцинного штамма, который обеспечил бы гомогенное производство F1, а также оценку вызываемого иммунного ответа и его защитных свойств против бубонной и легочной чумы.

Методы

Заявление об этике

Животные были размещены в зоопарке Institut Pasteur, аккредитованном Министерством сельского хозяйства Франции для проведения экспериментов на живых мышах (аккредитация B 75 15–01, выдана 22 мая 2008 г.), в соответствии с французскими и европейскими правилами ухода и защита лабораторных животных (Директива ЕС 86/609, Закон Франции 2001–486 от 6 июня 2001 г.).Протокол исследования был одобрен Министерством исследований Франции (N ° CETEA 2013–0038) и проводился в соответствии со страхованием благополучия животных NIH (№ A5476-01 от 02.07.2007).

Бактериальные штаммы и условия культивирования

Модель Y . псевдотуберкулез и Y . Изоляты pestis , использованные в этом исследовании, и их производные описаны в таблице S1 [17]. Бактерии выращивали при 28 ° C в бульоне Лурия-Бертани (LB) или на чашках с агаром LB с добавлением 0.002% (мас. / Об.) Гемина (LBH). Концентрации бактерий оценивали спектрометрическим методом при 600 нм и высевали на планшеты LBH или LB. Добавляли хлорамфеникол (Cm, 25 мкг / мл), ампициллин (Amp, 100 мкг / мл), канамицин (Km, 30 мкг / мл), спектиномицин (Spec, 50 мкг / мл) или иргасан (0,1 мкг / мл). в средствах массовой информации, когда это необходимо. Все эксперименты с Y . pestis штаммов были выполнены в лаборатории BSL3.

Клонирование

Чтобы внедрить оперон caf в Y . pseudotuberculosis хромосомы, использовался инструмент транспозиции Tn 7 [18]. Сначала была сконструирована mini-Tn 7 , содержащая кассету устойчивости Cm, путем клонирования I-фрагмента Cm-FRT Kpn из pFCM1 в pUCR6Kmini-Tn 7 , расщепленную Kpn I. Полученная плазмида, названная pUCR6K -miniTn7-Cm-FRT, затем расщепляли Apa I и Eco RI и лигировали с фрагментом 5 kb-PCR, содержащим весь оперон caf из Y . pestis амплифицирован с праймерами A (5’-ATAAGAATGAATTCGTGACTGATCAATATGTTGG-3 ’) и B (5’-CGTTAGGGCCCGTCAGTCTTGCTATCAATGC-3’), которые добавляли Apa I и Eco-фрагмент RI сайтов. Чтобы вставить локус caf в Y . pseudotuberculosis Хромосома V674, плазмиды pUC18R6KTn 7 — caf -Cm ^R и pTNS2 (провайдер транспозазы) вводили вместе в V674 с помощью электропорации.Транспозанты отбирали на чашках с агаром LB, содержащим хлорамфеникол, и проверяли их чувствительность к ампициллину. Наличие транспозона Tn 7 — caf -Cm ^R в хромосомном сайте att-Tn7 было проверено с помощью ПЦР с использованием двух пар праймеров: A (5′-CACAGCATAACTGGACTGATTTC-3 ‘) и B (5’ — GCTATACGTGTTTGCTGATCAAGATG-3 ‘) для левого перехода и C (5′-ATTAGCTTACGACGCTACACCC-3′) и D (5’-ACGCCACCGGAAGAACCGATACCT-3 ‘) для правого перехода.

Рекомбинантный Y . pseudotuberculosis Штамм , содержащий в своей хромосоме область Tn 7 — caf -Cm ^R , первоначально был назван V674TnF1, и его использование в качестве вакцины против чумы защищено патентной заявкой PCT / IB2012 / 001609, выданной в августе. 7, 2012. Для простоты в дальнейшем мы будем называть этот штамм VTnF1.

Для анализа продукции капсулы F1 бактерии визуализировали с помощью оптической микроскопии в контакте с чернилами, и был проведен анализ ELISA для количественной оценки капсулы F1 на бактериях, как описано ранее [17].

Строительство биолюминесцентного

Транспозон mini-Tn 7 , содержащий кассету устойчивости к Km, был сконструирован путем клонирования I-фрагмента Km-FRT Sac из pFKM1 в pUCR6Kmini-Tn 7 , расщепленный с помощью Sac I. Рекомбинантный pUCR6KTn 7 Плазмиду -Km затем расщепляли с помощью Apa I и Xma I и лигировали с фрагментом 5878 bp Apa I / Xma I из pGEN- lux (поставщик LuxCDABE; [19]).Полученную плазмиду pUCR6KTn 7 — luxCDABE затем расщепляли с помощью Spe I и Xma I и лигировали с промоторной областью 109 п.н. ail (YPO2905), полученной из Y . ДНК-матрица pestis с помощью ПЦР с праймерами E (5′-CGCACTAGTTGGAATACTGTACGAATATCC-3 ‘) и F (5’-ataCCCGGGccagattgttataacaatacc). Полученная плазмида была названа pUCR6KTn 7 -P ail-lux . Для транспонирования Tn 7 -P ail — люкс в Y .Хромосома pestis , плазмиды pUCR6KTn 7 -P ail-lux и pTNS2 вводили в бактериальные клетки CO92 путем электропорации. Транспозанты отбирали для чашек с агаром LBH, содержащим Km. Проверка рекомбинанта CO92 :: Tn7-P ail-lux была выполнена с помощью ПЦР с использованием пар праймеров A / B и C / D для хромосомной интеграции и путем измерения эмиссии фотонов с использованием планшет-ридера Xenius (SAFAS Monaco) для биолюминесцентная активность. Вирулентность рекомбинантного производного CO92 :: Tn7-P ail-lux при s.c. Была проверена инъекция, и было обнаружено, что она аналогична таковой для штамма дикого типа со средней летальной дозой (LD ₅₀ ) 10 КОЕ. In vivo. визуализацию выполняли с помощью системы визуализации In vivo (IVIS 100, Caliper Life Sciences).

Иммунизация животных и анализы in vivo

Вакцинацию мышей проводили в помещении для животных BSL3, как описано ранее [17]. Животные представляли собой семинедельных самок мышей OF1 или (если указано) мышей C57BL / 6 из Charles River France.Бактериальные суспензии (200 мкл в физиологическом растворе) вводили мышам внутрижелудочно (например) с помощью изогнутой иглы для кормления. Через день животных наблюдали на предмет страданий (прострация, взъерошенная шерсть) и взвешивали для оценки воздействия вакцинации. Вирулентность штамма VTnF1 при пероральном введении тестировали путем инфицирования, например, заражения. группы мышей (по четыре на дозу) с увеличивающимися дозами бактерий для определения LD ₅₀ . Значение LD ₅₀ было рассчитано методом Спирмена-Карбера [20]. In vivo распространение штамма VTnF1 исследовали, как описано ранее [17]. Кал (два фекальных осадка) собирали у живых мышей и гомогенизировали в PBS с использованием одноразовых гомогенизаторов (Piston Pellet от Kimble Chase, Fisher Sci.). Пейеровы пятна, селезенка, печень и брыжеечные лимфатические узлы были собраны в асептических условиях у умерщвленных мышей. Их гомогенизировали в стерильном PBS с использованием стеклянных шариков диаметром 3 мм и электрической мельницы (TissueLyser, Qiagen). Бактериальную нагрузку определяли путем посева серийных разведений гомогенатов.

Эксперименты по вызову чумы

Мышей заражали через четыре недели или шесть месяцев после вакцинации. Г . Штаммы pestis выращивали при 28 ° C на чашках LBH и готовили суспензии в физиологическом растворе для инфекций. Мыши были заражены подкожно. инъекция (100 мкл) в кожу вентральной области linea alba . LD ₅₀ штамма CO92Δ caf этим путем определяли путем инфицирования мышей (шесть на дозу) серийными разведениями бактериальных суспензий, и было обнаружено, что она составляет 100 КОЕ.Чтобы вызвать легочную чуму, мышей под наркозом инфицировали i.n. как описано ранее [17], закапывая 10 мкл бактериальной суспензии в ноздри (по 5 мкл в каждую). За выживаемостью животных наблюдали 21 день.

Оценка иммунного ответа

Кровь мышей собирали через три недели после вакцинации от живых животных путем пункции верхнечелюстной артерии ланцетом Goldenrod (Medipoint, США). Планшеты для микротитрования (NUNC) были покрыты либо антигеном F1, либо ультразвуком Y . pestis CO92Δ caf штамм (10 мкг / мл). Антиген F1 был получен от Y . pestis , как описано ранее [21]. Ультразвук Y . Штамм pestis CO92Δ caf был получен обработкой ультразвуком бактерий, выращенных при 37 ° C на агаре LB, как описано ранее [17]. Антигены Yops очищали, как описано ранее [22], и анализы выполняли, как описано ранее [17]. Вкратце, чашки блокировали 5% обезжиренным сухим молоком и 0.1% Твина 20 в PBS. Сыворотки, серийно разведенные в PBS, содержащем 0,1% BSA, инкубировали в лунках, и связанные антитела выявляли с использованием крысиных антител, связанных с пероксидазой хрена (HRPO), специфичных для мышиного IgG (Bio-Rad). Активность HRPO выявляли с использованием субстрата TMB (OptiEIA, BD Pharmingen). Титры антител (Ab) рассчитывали как обратную величину для самого низкого разведения образца, дающего сигнал, равный двукратному фону. Для анализа изотипов иммуноглобулинов использовали связанные с пероксидазой хрена (HRP) зонды, направленные против мышиных IgG1, IgG2a, IgG2b и IgM (Caltag).IgG3 выявляли с помощью несвязанного козьего антитела (Abcam) и выявляли с помощью связанного с HRP кроличьего антитела против козьего IgG (BioRad). Для вестерн-блоттинга Y . pestis CO92, дикого типа и Δ caf , S1 Table) кипятили в буфере для образцов Лэммли (Thermo) и загружали в 12% акриламидный гель для разделения SDS-PAGE с использованием устройства MiniProtean (BioRad). Мигрировавший материал переносили из геля на PVDF-мембрану (Amersham). Все последующие этапы выполнялись в соответствии с протоколом западного иммуноблоттинга, рекомендованным Cell Signaling Technology (США).Мембранные полоски инкубировали в течение ночи в объединенных сыворотках, разведенных 1/100, от наивных мышей или мышей, вакцинированных месяцем ранее. Связанный IgG выявляли с использованием вторичного козьего антимышиного IgG, связанного с пероксидазой хрена (BioRad). Набор ECL Plus (Pierce) использовали для выявления пероксидазы, а мембраны фотографировали с использованием аппарата ChemiDoc (BioRad).

Для оценки клеточной памяти вакцинированных животных спленоциты культивировали, как описано ранее [17]. Вкратце, селезенки умерщвленных животных были диссоциированы, а эритроциты лизированы с использованием гемолитического раствора Гей [23].Клетки, тщательно промытые холодным PBS, ресуспендировали в RPMI 1640 + Glutamax (Invitrogen) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, пенициллина + стрептомицина и 10 мМ -меркаптоэтанола. Клетки (5 × 10 ⁶ / состояние) стимулировали либо стерильным Y . pestis CO92Δ caf , обработанный ультразвуком (5 мкг / мл), стерильный антиген F1 (5 мкг / мл) или конканавалин A (1 мкг / мл; Sigma) в качестве положительного контроля. Через три дня супернатант собирали и содержание цитокинов определяли с использованием анализов IFNγ, IL-1β, IL-10 и IL-17 (Duosets, R&D Systems).

Статистический анализ

Для сравнения кривых выживаемости использовали логранговый тест (Мантел-Кокса). Непарные t-критерии Манна-Уитни или Стьюдента использовали для сравнения количества бактерий, веса животных, титров антител и продукции цитокинов. Для получения результатов биолюминесценции использовали парный тест Манна-Уитни. Анализы выполняли с помощью программного обеспечения Prism 6.0 (GraphPad Software).

Результаты

Строительство

VTnF1 был сконструирован путем вставки оперона caf , кодирующего F1 [17], в хромосому ослабленного Y . pseudotuberculosis V674, используя технологию транспозона mini-Tn 7 [18]. Получение капсулы F1 рекомбинантным VTnF1, выращенным при 37 ° C в бульоне LB, было протестировано с помощью F1-специфичного экспресс-теста с полосками [21], который был явно положительным для F1 (S1 рис.). Визуализация VTnF1 в индийских чернилах под микроскопом показала, что все бактериальные клетки VTnF1 продуцируют капсулу F1, о чем свидетельствует отталкивание частиц чернил сравнимой толщины (рис. 1А). Это контрастировало с культурами V674pF1, которые отображали инкапсулированные и неинкапсулированные бактерии.Для количественной оценки продукции капсул F1 изолированные колонии, полученные после роста в бульоне LB при 37 ° C, тестировали с использованием F1-специфического ELISA. Все колонии VTnF1 были F1-положительными, и их уровни F1 были гомогенными (рис. 1B), тогда как колонии V674pF1 демонстрировали различные уровни F1 на своей поверхности, что указывает как на гетерогенность, так и на нестабильность продукции F1. VTnF1 произвел столько же F1, сколько Y . pestis , и это производство зависело от температуры (рис. 1C).

Рис. 1. Производство капсул F1.

(A) Бактерии V674, V674pF1 и VTnF1, выращенные при 37 ° C, ресуспендировали в чернилах India и наблюдали под микроскопом. (B) Чтобы оценить стабильность продукции F1, изолированные колонии Y . pestis CO92 или Y . pseudotuberculosis V674pF1 и VTnF1 были получены после трех пересевов in vitro. Изолированные колонии VTnF1 были также получены путем культивирования гомогената пейеровских пластырей, взятых у мышей, ранее инокулированных VTnF1 (10 ⁸ КОЕ i.грамм.; отмечен «in vivo»). Серийные разведения бактерий тестировали с использованием F1-специфического ELISA, и показанный индекс F1 был рассчитан как 1 / КОЕ, что дает DO _{450 нм} = 1 в ELISA. Неинкапсулированный V674 использовали в качестве отрицательного контроля. (C) Производство F1 с помощью VTnF1 сравнивалось с производством Y . pestis CO92 после выращивания при 28 ° C или 37 ° C с использованием F1-специфического ELISA, и CO92Δ caf использовали в качестве отрицательного контроля.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g001

Стабильность продукции F1 дополнительно тестировали после роста VTnF1 in vivo на мышах. С этой целью вводили VTnF1, например. животным, а через пять дней бактерии были выделены из пятен Пейера. Все колонии VTnF1 были положительными на F1 с помощью ELISA (рис. 1B). Продукция F1 была гомогенной и сопоставима с уровнями F1 колоний, полученных после культивирования in vitro. Это демонстрирует, что VTnF1 стабильно и гомогенно продуцирует F1 после выращивания in vivo на мышах.

VTnF1 быстро выводится из перорально инокулированных мышей

Штамм V674, использованный для конструирования VTnF1, был сильно ослаблен после внутрижелудочной инокуляции мышам (LD ₅₀ > 10 ¹⁰ КОЕ; [17]).VTnF1 демонстрировал ослабление вирулентности, аналогичное V674 и предыдущей вакцине V674pF1, с LD ₅₀ > 10 ¹⁰ КОЕ. У мышей, вакцинированных VTnF1 в дозе 10 ⁸ КОЕ, наблюдались временные признаки инфекции (взъерошенные волосы) и небольшая задержка набора веса с третьего по седьмой день после вакцинации (в среднем 1,7 г), но они вернули нормальный вес. с 10-го дня (S2 рис.). Капсула F1 не обязательна для Y . pestis вирулентность у многих линий мышей [24–27], но не у других, таких как C57BL / 6 [28].Когда высокая доза VTnF1 (4 × 10 ⁹ КОЕ) была введена перорально мышам C57BL / 6 (N = 7), летальности в течение трех недель наблюдения не наблюдалось. Это подтвердило, что VTnF1 сильно ослаблен даже для мышей C57BL / 6, которые более восприимчивы к действию F1.

После пероральной инокуляции VTnF1 (10 ⁸ КОЕ) бактерии были обнаружены на пятый-шестой день в кале и пейеровских пятнах всех мышей (рис. 2A и 2B), а также в селезенке, печени и мезентериальных лимфатических узлах (рис. 2A и 2B). MLN) большинства животных (рис. 2C и 2E).Однако бактерии почти полностью исчезли из селезенки, пейеровых пятен и MLN через 15 дней и из печени через 26 дней. Ежемесячный анализ кала в течение следующих 5 месяцев оставался отрицательным, что указывало на выведение вакцины из внутренних органов и просвета кишечника.

Рис. 2. Распространение VTnF1 in vivo после пероральной вакцинации.

Группы мышей были инокулированы перорально вакциной VTnF1 (10 ⁸ КОЕ) и умерщвлены в указанные моменты времени для оценки нагрузок VTnF1 в: (A) фекалиях (две гранулы / мышь), (B) пейеровских бляшках ( два пятна / мышь), (C) селезенка (весь орган), (D) печень (весь орган) и (E) брыжеечные лимфатические узлы (все).Образцы измельчали ​​и разведения высевали на чашки с селективным агаром, содержащим канамицин, для подсчета колоний с пределом обнаружения 10 КОЕ / образец. Показаны индивидуальные значения для 7–14 мышей в каждом состоянии. Горизонтальная линия указывает медианное значение. Для статистического анализа использовали критерий Манна-Уитни: *: p ≤0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g002

Гуморальный иммунный ответ, вызываемый VTnF1, нацелен на несколько антигенов, включая F1, и является продолжительным

Гуморальный иммунный ответ, вызванный вакцинацией VTnF1 (10 ⁸ КОЕ перорально), сначала оценивали путем количественного определения сывороточных антител против очищенного F1 в разное время после вакцинации в течение шести месяцев.Анти-F1 IgG выявлялись уже через четыре дня после вакцинации и достигли плато через 7 дней (рис. 3А). Затем они поддерживались на высоких уровнях без значительного изменения, о чем свидетельствует тот факт, что титры, наблюдаемые через шесть месяцев (d180), существенно не отличались от титров на d30 (p = 0,08, 14 мышей на группу). Анализ изотипов иммуноглобулинов показал, что оба IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 вносят вклад в этот гуморальный ответ, тогда как IgM быстро достигает пика после вакцинации, а затем падает до низких уровней (рис. 3B).

Рис. 3. Гуморальный иммунный ответ, вызванный вакцинацией.

(A) Продукция антител, индуцированная вакцинацией против VTnF1 (10 ⁸ КОЕ), определялась количественно в различные дни после вакцинации с использованием ELISA для измерения IgG, направленного против очищенного антигена F1. Показаны средние ± среднеквадратические титры, наблюдаемые в двух экспериментах, проведенных в течение первого месяца после вакцинации (опыт 1, 7 мышей) и в течение шестимесячного периода после вакцинации (опыт 2, 14 мышей). Средние титры IgG в каждый момент времени статистически сравнивались с титрами в нулевой день с использованием теста Манна-Уитни, и все они были значительно выше (p <0.001), за исключением тех, что в день 1. (B) Различные изотипы Ig мыши, присутствующие в сыворотке, анализировали в последовательные моменты времени. (C) Ответ IgG против антигенов, отличных от F1, анализировали с помощью ELISA против Y . pestis CO92Δ caf обработали ультразвуком и (D) вестерн-блоттингом. Модель Y . pestis CO92 дикого типа или CO92Δ caf (обозначено F1-) использовали в качестве источника блоттированных антигенов и сывороток, собранных либо от наивных мышей, либо от мышей, вакцинированных 30 днями ранее (отмечен VTnF1).Полоса Caf1 обозначена звездочкой, а группа Caf1M — треугольником. (E) Ответ против очищенных Yops также анализировали с помощью ELISA. Показаны результаты для 14 отдельных животных (точки) и медианы групп (горизонтальная линия). Для статистического анализа использовали критерий Манна-Уитни: ***: p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g003

IgG, распознающий Y . Антигены pestis , отличные от F1, количественно определяли с помощью ELISA с использованием ультразвуковой обработки Y . pestis CO92Δ caf в качестве цели. Все вакцинированные мыши имели высокое количество IgG против Y . pestis CO92Δ caf антигенов (фиг. 3C). Вестерн-блоттинг (фиг. 3D) подтвердил, что в дополнение к F1, по крайней мере, 12 целевых антигенов распознавались иммунными сыворотками. Поскольку конформационные эпитопы были потеряны из-за денатурирующих условий, используемых для электрофореза, реальных мишеней, вероятно, было больше. Среди хорошо узнаваемых антигенов присутствуют два компонента оперона Caf (отсутствующие в штамме CO92Δ caf , рис. 3D): антигены Caf1 и Caf1M (MW 15.6 и 28,7 кДа соответственно). Наконец, были также измерены IgG против очищенных Yops, потому что эти молекулы являются необходимыми Y . pestis факторов вирулентности. Такие IgG наблюдались почти у всех мышей, но с разными уровнями (рис. 3E). В целом, наши результаты показывают, что гуморальный иммунный ответ быстро развивался после однократной вакцинации и включал все основные изотипы IgG. Антитела распознавали несколько антигенов, отличных от F1, и поддерживались на высоком уровне в течение длительных периодов времени без повторной вакцинации.

VTnF1-индуцированные клетки памяти, направленные на F1 и другие антигены, обладают провоспалительным функциональным профилем

Для оценки антиген-специфической Т-клеточной памяти, вызванной VTnF1, спленоциты, взятые у вакцинированных животных, повторно стимулировали in vitro либо очищенным антигеном F1, либо обработкой ультразвуком неинкапсулированного Y . pestis CO92Δ caf . Клетки мышей, вакцинированных одним месяцем ранее VTnF1, продуцировали IFNγ, IL-17 и IL-10 в ответ на F1 (рис. 4).Хотя эти уровни были низкими, они были значительно выше, чем у контрольных мышей (рис. 4), что указывает на то, что вакцинация мобилизовала F1-специфические Т-клетки памяти, продуцирующие как про- (IFNγ, IL-17), так и противовоспалительные (IL-10). цитокины. Также измерялась продукция IL-1β, но уровни были очень низкими (<0,02 нг / мл) во всех условиях.

Рис. 4. Клеточный иммунный ответ вакцинированных мышей.

Спленоциты, выделенные от мышей, вакцинированных перорально VTnF1 (10 ⁸ КОЕ) на 30 дней (темно-красные прямоугольники) или 180 дней (черные прямоугольники) ранее, или от невакцинированных (наивных) мышей (синие прямоугольники), стимулировали in vitro. с 5 мкг / мл любого антигенного препарата Y . pestis CO92Δ caf (обозначено Y . p .F1 ^—) или очищенный антиген F1, или митоген Конканавалин A (ConA, 1 мкг / мл) в качестве положительного контроля. Супернатанты, взятые через три дня после стимуляции, тестировали на присутствие IFNγ (A), IL-17 (B) и IL-10 (C) с помощью ELISA. Показаны средние значения ± среднеквадратичное отклонение. из 14 мышей на условие (два объединенных эксперимента). Для статистического анализа использовали непарный критерий Манна-Уитни: *: p <0,05, **: p <0,01, ***: p <0.001, нс: не имеет значения. Сопоставимые результаты были получены в двух других экспериментах с использованием наивных и вакцинированных через 30 дней мышей (по 16 на группу).

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g004

Напротив, клетки мышей, вакцинированных VTnF1, продуцировали высокие количества IFNγ и IL-17 в ответ на не-F1 Y . pestis , достигая уровней, по крайней мере, в 10 раз выше, чем уровни, наблюдаемые для клеток от наивных мышей (рис. 4A и 4B). Поразительно, что уровни IL-17 были сопоставимы с уровнями, индуцированными митогенным лектином ConA, используемым в качестве положительного контроля, что указывает на то, что большая часть отвечающих спленоцитов вакцинированных животных распознает антигены Yersinia и проявляет мощные провоспалительные функции.Этот клеточный ответ также был намного выше, чем тот, который стимулировался одним антигеном F1, что отражает мобилизацию Т-клеток, направленных против множества Y . pestis антигенных мишеней.

Д . pestis Антигены индуцировали выработку IL-10 спленоцитами как у наивных, так и у вакцинированных мышей, вероятно, из-за реакции клеток врожденного иммунитета, таких как макрофаги. Однако спленоциты от вакцинированных мышей продуцировали значительно более высокие уровни IL-10, чем клетки от наивных мышей, стимулированных как F1, так и другими антигенами, выявляя ответную реакцию Y . pestis -специфические клетки памяти с противовоспалительной активностью (рис. 4С).

Для оценки устойчивости клеточно-опосредованного ответа также были протестированы спленоциты мышей, вакцинированных шестью месяцами ранее. Уровни IFNγ, IL-17 и IL-10 в ответ на антигены F1 и не-F1 были ниже на 180-й день, чем на 30-й день после вакцинации, но это различие не было статистически значимым. Таким образом, клеточно-опосредованная память сохранилась через шесть месяцев, хотя и немного уменьшилась.

VTnF1 обеспечивает высокую защиту как от бубонной, так и от легочной формы чумы

Для определения защитной эффективности VTnF1 против легочной чумы вакцинированных мышей интраназально заражали полностью вирулентным Y . pestis CO92 через четыре недели после однократной пероральной вакцинации (10 ⁸ КОЕ VTnF1). 100% мышей заражали 10 ⁵ КОЕ (33 LD ₅₀ ) Y . pestis CO92 выжили (рис. 5A). Вакцинация также защищала 100% животных, подвергшихся чрезвычайно серьезному заражению 10 ⁷ КОЕ CO92 (т.е. 3300 LD ₅₀ ; рис. 5A), тогда как предыдущий вакцинный штамм V674pF1 защищал только 80% мышей, инфицированных этой дозой. [17].Таким образом, VTnF1 выглядит более защищенным.

Рис. 5. Защита от бубонной и легочной чумы мышей, вакцинированных VTnF1.

Мышей, получивших однократную пероральную дозу VTnF1 (10 ⁸ КОЕ), заражали через i.n. или п. маршрутами, с различными дозами бактерий, как указано. (A-D) Животных заражали через четыре недели после вакцинации путем инъекции (A, B) Y . pestis CO92, или (C, D) неинкапсулированный CO92Δ caf . (E) Вакцинированных мышей заражали через шесть месяцев после вакцинации.Выживаемость мышей регистрировали ежедневно в течение 21 дня. Число выживших мышей / число протестированных животных указано над соответствующей полосой для каждого состояния. Для статистического анализа использовался точный критерий Фишера: *: p≤0,05; ***: p <0,001.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g005

Для оценки защитной эффективности VTnF1 против бубонной чумы вакцинированные мыши были инфицированы подкожно. с Y . pestis CO92, через четыре недели после вакцинации.Однократная пероральная доза (10 ⁸ КОЕ) вакцины против VTnF1 защищала 100% мышей от 10 ³ КОЕ (100 LD ₅₀ ) CO92 (рис. 5B). По сравнению с V674pF1, который защищал только 81% (13/16) животных от бубонной чумы в этих условиях, VTnF1 снова был более защитным. Когда животные, вакцинированные VTnF1, получали очень серьезное заражение подкожно. инъекции 10 ⁵ КОЕ CO92 (10000 LD ₅₀ ), 93% мышей (13/14) все еще были защищены.

Поскольку известно, что иммунная память со временем снижается, защита, обеспечиваемая VTnF1, оценивалась через шесть месяцев (одна треть продолжительности жизни мыши OF1 [29] после пероральной однократной вакцинации VTnF1.VTnF1 полностью не обнаруживался в кале мышей на 30-й день после вакцинации и в последующие месяцы. На s.c. вызов с 100 LD ₅₀ из Y . pestis CO92, 93% животных все еще были защищены от бубонной чумы. Более того, 50% мышей выжили внутримышечно. вызов с 33 LD ₅₀ из Y . pestis CO92 через шесть месяцев после вакцинации (рис. 5D). Это указывает на то, что иммунная память, вызванная вакциной, сохраняется и обеспечивает длительную защиту.

Способность вакцинации против VTnF1 обеспечивать защиту от бубонной чумы, вызываемой неинкапсулированным Y . pestis также оценивали путем заражения вакцинированных мышей Y . pestis CO92Δ caf . Однократная пероральная доза VTnF1 обеспечивала 100% защиту от серьезного интраназального заражения с 10 ⁷ КОЕ из Y . pestis (10 ⁷ КОЕ, т.е. 3300 LD ₅₀ , рис. 5C). Эта же вакцинация защитила 93% вакцинированных мышей от тяжелой формы s.c. Проба с 10 ⁵ КОЕ (10 ⁴ LD ₅₀ ; Рис. 5D). Таким образом, VTnF1 давал сильную защиту от Y . pestis в отсутствие псевдокапсулы F1, что указывает на то, что даже если чума была вызвана природным или генетически модифицированным F1-отрицательным Y . pestis , вакцинация VTnF1 обеспечит высокий уровень защиты.

Вакцинированные мыши быстро контролируют

Для определения стадии инфекционного процесса, на которой иммунитет, обеспечиваемый VTnF1, контролируется Y . pestis распространение, заражение биолюминесцентным веществом Y . Штамм pestis (CO92 Tn7 ail — люкс ) исследовали in vivo на живых мышах. Штамм несет в своей хромосоме оперон lux под контролем промотора ail , который, как известно, очень активен во время бубонной чумы [30]. У невакцинированных животных Y . pestis размножались в месте инъекции и распространились на другие органы, что привело к гибели двух мышей из пяти через 92 часа после инъекции.(Рис. 6A). У мышей, вакцинированных VTnF1, сигнал биолюминесценции был намного ниже через 20 часов в месте инъекции (фиг. 6B) и через 44 часа он больше не был виден. Распространения за пределы места инъекции у вакцинированных мышей не наблюдалось. Следовательно, вакцинация индуцировала быстродействующие иммунные механизмы, которые предотвращали распространение Y . pestis от места инъекции.

Рис. 6. Вакцинация VTnF1 предотвращает Y . pestis распространение из очага заражения.

(A) Мыши, вакцинированные VTnF1 (10 ⁸ КОЕ, внутрибрюшинно), были инфицированы через четыре недели подкожно. введение 10 ³ КОЕ биолюминесцентного Y . pestis CO92 :: Tn7-P ail — люкс в брюшной коже. Биолюминесценцию всего тела животных регистрировали через регулярные промежутки времени с помощью камеры IVIS. Показаны фотографии в белом свете, объединенные с сигналом биолюминесценции, в масштабе справа. (B) Интенсивность биолюминесценции, испускаемой в месте инъекции, измеряли для каждого животного, и показаны средние значения ± s.Эм. для каждой группы. Животные, пропавшие без вести в момент времени 92 ч, умерли от инфекции до записи биолюминесценции. Для статистического анализа использовался парный критерий Манна-Уитни: **: p <0,01.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.g006

Обсуждение

Чтобы удовлетворить потребность в вакцине, способной придавать защитный иммунитет против бубонной и легочной чумы, мы ранее сконструировали генетически модифицированную вакцину Y . pseudotuberculosis V674pF1 кандидатная чумная вакцина, которая производит Y . pestis F1 антиген [17]. Хотя эта вакцина защищала от ингаляционного воздействия Y . pestis , защита от бубонной чумы не была полной. Это отсутствие полной защиты потенциально объяснялось тем, что продукция антигена F1 была нестабильной. Таким образом, цель настоящей работы заключалась в улучшении вакцины путем создания нового штамма с повышенной устойчивостью и эффективностью.

Потеря продукции F1 V674pF1 в основном является результатом нестабильности плазмиды.Другим, кто использовал Salmonella в качестве приемника оперона caf , приходилось применять постоянное давление антибиотика in vitro для обеспечения устойчивости плазмиды, но это давление не могло поддерживаться in vivo [31]. Здесь оперон caf был транспонирован в хромосому [18], и мы показываем, что продукция капсулы F1 с помощью VTnF1 была сопоставима с производством Y . pestis , тогда как продукция F1 с помощью V674pF1 была гораздо более неоднородной и нестабильной. Стабильность характеристик VTnF1 позволит крупномасштабное производство живой вакцины в соответствии с надлежащими производственными процедурами.

VTnF1 обеспечивает высокую защиту как от бубонной, так и от легочной чумы и более эффективен, чем V674pF1, использованный в той же дозе (10 ⁸ КОЕ) и испытанный в тех же условиях [17]. Ранее мы сообщали, что только 80% мышей, вакцинированных V674pF1, пережили заражение высокой дозой легочной чумы (10 ⁷ КОЕ CO92) или умеренное заражение бубонной чумой (10 ³ КОЕ). Напротив, VTnF1 обеспечивает полную защиту от часто используемых бактерий и почти полную защиту от очень серьезных угроз.Поскольку и V674pF1, и VTnF1 являются производными аттенуированного штамма V674, единственное возможное объяснение этой разницы в защите — более гомогенная и длительная продукция псевдокапсулы F1 с помощью VTnF1. Антиген F1 может активировать макрофаги [32], что является адъювантным эффектом, благоприятным для адаптивного иммунного ответа. Следовательно, эффективность VTnF1 может быть результатом более сильной стимуляции макрофагов и, возможно, также дендритных клеток, принадлежащих к одному и тому же клону, что способствует более эффективному укреплению иммунитета.

Наблюдаемый высокий уровень защиты особенно примечателен, поскольку он был получен с помощью однократной пероральной дозы вакцины. Такая очень простая процедура является ключевым преимуществом по сравнению с повторными инъекциями, которые требуются большинству вакцин для обеспечения защиты, продленной во времени. Трудно выполнить в полевых условиях, повторные инъекции рассматриваются органами здравоохранения как ограничение для массовой вакцинации.

Мыши, вакцинированные VTnF1, очень быстро контролируют Y . pestis в месте попадания на кожу.Это говорит о том, что легко мобилизуемые эффекторы, такие как антитела и фагоциты, достигают инфицированной ткани. Антитела могут играть важную роль в защите, обеспечиваемой VTnF1, о чем свидетельствуют высокие титры антител у вакцинированных мышей. VTnF1 демонстрирует гораздо большее антигенное разнообразие, чем разрабатываемые в настоящее время молекулярные вакцины против чумы, которые состоят только из антигенов F1 и LcrV. Иммунный ответ, индуцированный VTnF1, нацелен на различные Y . pestis белков в дополнение к антигенам Caf1 и Caf1M.Такое разнообразие мишеней важно для защиты от бактерий, которые могут терять антигены-мишени через делеции генов, как это наблюдается для антигена Caf1 / F1 [33]. Известно, что анти-F1 IgG обеспечивает защиту путем опсонизации Y . pestis , чему способствует численность F1 и поверхностная локализация [25, 26, 34]. В то время как обильный анти-F1 IgG, индуцированный VTnF1, вероятно, играет центральную защитную роль против дикого типа (инкапсулированный в F1) Y . pestis [25, 27, 34, 35], устойчивость вакцинированных мышей к чуме, вызванная F1-отрицательным Y .Штамм pestis демонстрирует, что антитела, направленные против других антигенов, также способствуют защите.

Д . pestis F1-специфический IgG, индуцированный VTnF1, выявляется уже через четыре дня после вакцинации, быстрая кинетика сравнима с кинетикой, наблюдаемой после вакцинации растворимым рекомбинантным F1 [36]. Это быстрое начало продукции IgG указывает на то, что VTnF1 быстро взаимодействует с лимфоидными клетками, вероятно, в пейеровских бляшках, мезентериальных лимфатических узлах и селезенке, где наблюдался VTnF1.Быстрое переключение гуморального ответа с IgM на антитела изотипов IgG1, два и три, как правило, с высокой аффинностью, указывает на сильный Т-клеточный ответ. Наличие большого количества IgG3 также указывает на распознавание углеводных мишеней [37]. Это разнообразие благоприятно для опсонизации через все рецепторы Fcγ и предполагает участие различных подтипов В-клеток в индуцированном вакциной ответе [38]. Поскольку уровни IgG повышаются в течение первой недели и достигают уровней плато, наблюдаемых в течение следующих шести месяцев, их вклад в защиту от чумы на 30-й день может быть доступен уже на седьмой день.

Клеточный иммунитет играет важную роль против чумы [39, 40] и выполняет важные защитные функции во время гуморальной защиты от легочной чумы [41]. Молекулярные вакцины с адъювантом квасцов являются слабыми индукторами этой части иммунного ответа [12, 13]. Напротив, VTnF1 вызывал сильный клеточно-опосредованный ответ без адъюванта. Часть ответа отзываемых клеток была направлена ​​против F1, но наиболее важная часть была направлена ​​против антигенов, отличных от F1. Его интенсивность, с ИЛ-17, сопоставимая с митогенной стимуляцией Конканавалином А, указывает на вовлечение большого процента спленоцитов, которые, вероятно, распознают несколько антигенных мишеней.Клетки памяти продуцировали IFNγ, IL-17 и IL-10, составляя смешанный профиль Th2-Th27. IFNγ-зависимый иммунный ответ типа 1 необходим для защиты от чумы, индуцированной вакциной [39]. IFNγ, полученный из Т-клеток памяти, инструктирует мощную активацию врожденных клеток, что приводит к быстрому защитному иммунитету против вторжения микроорганизмов [42]. Т-лимфоциты, продуцирующие IL-17 (клетки Th27), необходимы для лечения легочной чумы [43] из-за важной роли, которую играет IL-17 в индукции антимикробных пептидов и привлечении полиморфно-ядерных лейкоцитов [44].Ответ памяти, индуцированный VTnF1, также включает выработку противовоспалительного цитокина IL-10, который уравновешивает потенциально вредные эффекты IL-17 [45]. В дополнение к этим прямым функциям Т-клетки играют важную роль в антителозависимом иммунитете [40] и, таким образом, усиливают гуморальный ответ. В целом, иммунный ответ, индуцированный VTnF1, путем сочетания гуморальных и клеточных механизмов, обладает характеристиками, необходимыми для эффективного удаления Y . pestis .

Устойчивый гуморальный и клеточный иммунитет через шесть месяцев после вакцинации маловероятен в результате длительной стимуляции иммунитета живыми бактериями, поскольку через месяц после вакцинации VTnF1 не обнаруживался в кале и органах большинства мышей.IgG могут продуцироваться долгоживущими плазматическими клетками, которые отличаются от так называемых В-клеток памяти, и продуцируют обильное количество IgG без повторной стимуляции [46]. VTnF1 мог сохраняться в кишечнике через один месяц, например, за счет длительной колонизации слепой кишки, как недавно сообщалось [47], однако это маловероятно, потому что только вирулентные штаммы вызывают очаги слепой кишки, и они дают высокий уровень культивируемых бактерий в фекалиях.

Защитный иммунитет, обеспечиваемый VTnF1 после шестимесячного периода (93% против бубонной чумы и 50% против легочной чумы), является чрезвычайно длительным, поскольку шесть месяцев соответствуют одной трети жизни мыши [29], что сопоставимо с # 30 лет человеческой жизни.Учитывая, что и титры антител, и клеточная реактивность оставались высокими после шести месяцев, почти полная защита от бубонной чумы может быть результатом любого компартмента или, что более вероятно, их синергии [14]. Более низкая защита от легочной чумы указывает на то, что иммунитет легких является наиболее требовательным и требует одного или нескольких компонентов иммунного ответа, которые являются обязательными для защиты, но первыми снижаются со временем. Природу этого компонента приобретенного иммунитета еще предстоит определить, но, по-видимому, он не связан с переключением изотипа Ig или снижением выработки антител или IFNγ / IL-17.Одно из возможных объяснений состоит в том, что старение вызывает модификацию функций альвеолярных макрофагов со спонтанной активацией и снижением реакции на внешние раздражители, что способствует восприимчивости легких к инфекции [48, 49].

Прямое ослабление Y . pestis противочумные вакцины (EV76 и субклоны) ранее успешно применялись у людей, но могут вызывать сильные побочные эффекты [6, 7] и, как и все Y . pestis подвержены легкой генетической перестройке из-за большого количества инсерционных последовательностей в геноме [4, 8].Помимо генетической стабильности, VTnF1 сочетает в себе известные преимущества реплицирующихся вакцин: выявление гуморальных и клеточно-опосредованных иммунных ответов, устойчивость к мутантным микроорганизмам, легкость массового производства и использования, ограниченную стоимость и т. Д., Обеспечивая при этом гарантии с точки зрения ослабления. , стабильность и эффективность против бубонной и легочной чумы. Планы готовности к биотеррористическим атакам предполагают накопление миллионов доз вакцины. Однако запасы имеют ограниченный срок службы и, следовательно, требуют регулярного производства новых доз, что является быстро дорогостоящей стратегией [50].Живые вакцины можно быстро производить в массовых количествах, и теперь они рассматриваются как ценная альтернатива.

В заключение мы предлагаем вакцину, обеспечивающую высокий уровень защиты как от бубонной, так и от легочной чумы после однократной иммунизации. VTnF1 — это простая в производстве, генетически стабильная и необратимо аттенуированная вакцина, обеспечивающая длительную и высокоэффективную защиту как от дикого типа, так и от неинкапсулированных (F1-отрицательных) Y . pestis .Насколько нам известно, VTnF1 — единственная вакцина против чумы, о которой когда-либо сообщалось, которая может обеспечить высокую и длительную защиту как от бубонной, так и от легочной чумы после однократного перорального введения.

Дополнительная информация

S1 Рис. Обнаружение антигена F1, продуцируемого вакцинным штаммом VTnF1.

Для определения продукции капсул F1, тест-полоска, разработанная для обнаружения F1 [21], была использована на суспензии клеток рекомбинантного вакцинного штамма VTnF1, выращенного при 37 ° C в бульоне LB.Родительский штамм V674 был использован в качестве отрицательного контроля, поскольку он не имеет локуса caf и Y . pestis CO92 штамм использовали в качестве положительного контроля. Положительная полоса в том же положении, что и у Y . pestis , тогда как сигнал не был обнаружен с V674 Y . pseudotuberculosis , что указывает на то, что VTnF1 синтезирует антиген F1.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.s001

(DOCX)

S2 Рис. Контроль веса мышей после вакцинации.

Мышей взвешивали через равные промежутки времени после пероральной вакцинации VTnF1 (10 ⁸ КОЕ) или оставляли невакцинированными (Naïve). Показаны средства для 16 наивных мышей и 32 вакцинированных мышей. Группы сравнивали в каждый момент времени с использованием непарного t-критерия Стьюдента. *: p <0,05; **: р <0,01. нс: не имеет значения.

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004162.s002

(DOCX)

Благодарности

Авторы благодарят Софию Филали и Рима Багга за технические советы, а также Пьера Гуссенса и Ксавьера Монтагутелли за полезные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: AD EC CED. Проведены эксперименты: AD YH MK CED. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: AD EC CED. Написал документ: AD EC CED.

Ссылки

1. 1. КТО. Чума. Всемирная организация здоровья. 2005; (267).
2. 2. Бертерат Э., Бекхауча С., Чуграни С., Разик Ф., Дюшемин Дж. Б., Хоути Л. и др. Повторное появление чумы в Алжире через 50 лет, 2003 г. Новые инфекционные заболевания.2007. 13 (10): 1459–62. pmid: 18257987
3. 3. Шраг С.Дж., Винер П. Возникающие инфекционные заболевания: какова относительная роль экологии и эволюции? Тенденции эволюции и экологии. 1995; 10: 319–24.
4. 4. Chain PS, Carniel E, Larimer FW, Lamerdin J, Stoutland PO, Regala WM и др. Понимание эволюции Yersinia pestis посредством полногеномного сравнения с Yersinia pseudotuberculosis . Proc Natl Acad Sci USA. 2004. 101 (38): 13826–31.pmid: 15358858
5. 5. Guiyoule A, Gerbaud G, Buchrieser C, Galimand M, Rahalison L, Chanteau S и др. Переносимая плазмида-опосредованная устойчивость к стрептомицину в клиническом изоляте Yersinia pestis . Возникающие инфекционные заболевания. 2001. 7 (1): 43–8. pmid: 11266293
6. 6. Жирар Г. Иммунитет при чуме. Приобретения, полученные в результате 30-летней работы над штаммом «Pasteurella Pestis Ev» (Жирар и Робик). Биол Мед (Париж). 1963; 52: 631–731.
7. 7.Федорова В.А., Мотин ВЛ. Вакцины от чумы. В кн .: Федорова В.А., Мотин В.Л., ред. Вакцины против бактериальных возбудителей биологических опасностей. Керала, Индия: Указатель исследований; 2011. с. 175–233.
8. 8. Цуй Й, Ян Х, Сяо Х, Анисимов А.П., Ли Д., Ян Й и др. Генетические вариации живых аттенуированных штаммов вакцины против чумы (линия Yersinia pestis EV76) во время лабораторных пассажей в разных странах. Заразить Genet Evol. 2014; 26: 172–9. pmid: 24⁰
9. 9. Heath DG, Андерсон GW мл., Мауро Дж. М., Велкос С. Л., Эндрюс Г. П., Адамович Дж. И др. Защита от экспериментальной бубонной и легочной чумы с помощью рекомбинантной капсульной вакцины слитого белка с антигеном F1-V. Вакцина. 1998. 16 (11–12): 1131–7. pmid: 9682370
10. 10. Уильямсон Э.Д., Эли С.М., Гриффин К.Ф., Грин М., Рассел П., Лири С.Е. и др. Новая улучшенная субъединичная вакцина от чумы: основа защиты. FEMS Immunol Med Microbiol. 1995. 12 (3–4): 223–30. pmid: 8745007
11. 11. Берроуз TW. Антиген, определяющий вирулентность в Pasteurella pestis .Природа. 1956; 177: 426–7. pmid: 13309325
12. 12. Маннхальтер Дж. У., Нейчев Х. О., Злабингер Дж. Дж., Ахмад Р., Эйбл ММ. Модуляция иммунного ответа человека нетоксичным и апирогенным адъювантом гидроксидом алюминия: влияние на захват антигена и презентацию антигена. Клиническая и экспериментальная иммунология. 1985. 61 (1): 143–51. pmid: 3876178
13. 13. Dinc G, Pennington JM, Yolcu ES, Lawrenz MB, Shirwan H. Повышение эффективности Th2-клеток свинцовой субъединицы вакцины rF1-V Yersinia pestis с использованием SA-4-1BBL в качестве нового адъюванта.Вакцина. 2014. 32 (39): 5035–40. pmid: 25045812
14. 14. Смайлик ST. Актуальные проблемы в разработке вакцин против легочной чумы. Экспертный обзор вакцин. 2008. 7 (2): 209–21. pmid: 18324890
15. 15. Питт Л. Нечеловеческие приматы как модель легочной чумы. Гейтерсбург, Мэриленд, США. 2004 [цитируется в 2014 году]. http://www.fda.gov/cber/minutes/workshop-min.htm.
16. 16. Blisnick T, Ave P, Huerre M, Carniel E, Demeure CE. Оральная вакцинация против бубонной чумы с использованием живого авирулентного штамма Yersinia pseudotuberculosis .Заражение иммунной. 2008. 76 (8): 3808–16. pmid: 18505804
17. 17. Derbise A, Cerdà Marín A, Ave P, Blisnick T, Huerre M, Carniel E, et al. Инкапсулированная вакцина Yersinia pseudotuberculosis представляет собой высокоэффективную вакцину против легочной чумы. PLoS NTD. 2012; 6 (2): e1528.
18. 18. Choi KH, Gaynor JB, White KG, Lopez C, Bosio CM, Karkhoff-Schweizer RR, et al. Система клонирования и экспрессии бактерий широкого диапазона на основе Tn7. Нат методы. 2005. 2 (6): 443–8. Epub 2005/05/24.pmid: 153
19. 19. Лейн М.С., Алтери С.Дж., Смит С.Н., Мобли Х.Л. Экспрессия жгутиков совпадает с восхождением уропатогенной Escherichia coli в верхние мочевыводящие пути. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2007. 104 (42): 16669–74. pmid: 17

    9

20. 20. Гамильтон, Массачусетс, Руссо, Р.В. Терстон. Метод усеченного Спирмена-Карбера для оценки средних летальных концентраций в анализах токсичности. Экологическая наука и технологии.1977; 11 (7): 714–9.
21. 21. Chanteau S, Rahalison L, Ralafiarisoa L, Foulon J, Ratsitorahina M, Ratsifasoamanana L, et al. Разработка и тестирование экспресс-теста на бубонную и легочную чуму. Ланцет. 2003. 361 (9353): 211–6. pmid: 12547544
22. 22. Бенуа C, Guiyoule A, Carniel E. Серодиагностика человеческих инфекций — Yersinia патогенов. Presse Médicale. 1996. 25 (34): 1627–30.
23. 23. Мишелл Б., Шииги С. Избранные методы клеточной иммунологии.Сан-Франциско: W.H. Фримен и Ко; 1980. 23–4 с.
24. 24. Дэвис К.Дж., Фриц Д.Л., Питт М.Л., Велкос С.Л., Уоршем П.Л., Фридлендер А.М. Патология экспериментальной легочной чумы, вызванной фракцией 1-положительной и фракцией 1-отрицательной Yersinia pestis у африканских зеленых мартышек (Cercopithecus aethiops). Arch Pathol Lab Med. 1996. 120 (2): 156–63. pmid: 8712895
25. 25. Фридлендер AM, Welkos SL, Worsham PL, Andrews GP, Heath DG, Anderson GW и др. Взаимосвязь между вирулентностью и иммунитетом, как показали недавние исследования капсулы F1 Yersinia pestis .Clin Infect Dis. 1995; 21 (Приложение 2): S178 – S81. pmid: 8845449
26. 26. Quenee LE, Cornelius CA, Ciletti NA, Elli D, Schneewind O. Yersinia pestis caf1 вариантов и пределы защиты от чумной вакцины. Инфекция и иммунитет. 2008. 76 (5): 2025–2036. pmid: 18347051
27. 27. Велкос С.Л., Дэвис К.М., Питт Л.М., Уоршем П.Л., Фридлендер А.М. Исследования вклада ассоциированной с капсулой плазмиды pFra F1 в вирулентность Yersinia pestis .В: Ravagnan G, Chiesa C, редакторы. Иерсиниоз: настоящее и будущее. Вклад в микробиологию и иммунологию. 13. Постфах, CH-4009 Базель, Швейцария: Каргер; 1995. стр. 299–305.
28. 28. Weening EH, Cathelyn JS, Kaufman G, Lawrenz MB, Price P, Goldman WE и др. Зависимость капсулы Yersinia pestis от патогенеза зависит от мышиного фона. Инфекция и иммунитет. 2011. 79 (2): 644–52. pmid: 21115720
29. 29. Flurkey K, Currer J, Harrison DE.Мышиные модели в исследованиях старения. В: Fox JG, Davisson M, Quimby FW, Barthold SW, Newcomer CE, Smith AL, редакторы. Мышь в биомедицинских исследованиях (второе издание). Берлингтон: Academic Press; 2007. с. 637–72.
30. 30. Sebbane F, Lemaitre N, Sturdevant DE, Rebeil R, Virtaneva K, Porcella SF и др. Адаптивный ответ Yersinia pestis на внеклеточные эффекторы врожденного иммунитета при бубонной чуме. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки.2006. 103 (31): 11766–71. pmid: 16864791
31. 31. Маскелл Д.Д., Суини К.Дж., О’Каллаган Д., Hormaeche CE, Лью Ф.Й., Дуган Г. Мутанты Salmonella typhimurium aroA в качестве носителей термолабильной субъединицы B энтеротоксина Escherichia coli для секреторной и системной иммунной системы мышей. Microb Pathog. 1987. 2 (3): 211–21. pmid: 3333799
32. 32. Sodhi A, Sharma RK, Batra HV, Tuteja U. Рекомбинантный белок фракции 1 Yersinia pestis активирует перитонеальные макрофаги мыши in vitro.Клеточная иммунология. 2004. 229 (1): 52–61. pmid: 15331328
33. 33. Зимний CC, Cherry WB, Moody MD. Необычный штамм Pasteurella pestis , выделенный из смертельного случая чумы у человека. Bulletin de l’Organisation Mondiale de la Santé. 1960; 23: 408–9. pmid: 13845309
34. 34. Андерсон GW, Worsham PL, Bolt CR, Andrews GP, Welkos SL, Friedlander AM и др. Защита мышей от фатальной бубонной и легочной чумы путем пассивной иммунизации моноклональными антителами против белка F1 Yersinia pestis.Am J Trop Med Hyg. 1997. 56 (4): 471–3. pmid: 60
35. 35. Карр К.В., Хит Д.Г., Фридлендер А.М. Антифагоцитарный эффект капсульного белка F1 Yersinia pestis . Тезисы Общего собрания Американского общества микробиологов. 1997; 97: 96.
36. 36. Леви Ю.Ю., Флэшнер Ю., Тидхар А., Зауберман А., Афталион М., Лазар С. и др., Редакторы. Быстрое начало защитного иммунитета против чумы индуцируется F1, но не антигеном LcrV. Yersinia 11: 11-й Международный симпозиум по Yersinia ; 2013; Сучжоу, Китай.: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор.
37. 37. Перлмуттер Р.М., Хансбург Д., Брилес Д.Е., Николотти Р.А., Дэви Дж. М.. Ограничение подкласса мышиных антиуглеводных антител. J Immunol. 1978; 121 (2): 566–72. pmid: 79606
38. 38. Swanson CL, Pelanda R, Torres RM. Разделение труда при первичном гуморальном иммунитете. Immunol Res. 2013. 55 (1–3): 277–86. pmid: 22945808
39. 39. Элвин SJ, Уильямсон ED. Иммунные механизмы, опосредованные Stat 4, но не Stat 6, важны для защиты от чумы.Микробный патогенез. 2004. 37 (4): 177–84. pmid: 15458778
40. 40. Леви Ю., Флэшнер Ю., Тидхар А., Зауберман А., Афталион М., Лазар С. и др. Т-клетки играют важную роль в опосредованной анти-F1 быстрой защите от бубонной чумы. Вакцина. 2011; 29 (40): 6866–73. pmid: 21803090
41. 41. Родитель М.А., Вильгельм Л.Б., Куммер Л.В., Саба Ф.М., Малларки И.К., Смайли СТ. Гамма-интерферон, фактор некроза опухоли альфа и синтаза оксида азота 2, ключевые элементы клеточного иммунитета, выполняют важные защитные функции во время гуморальной защиты от летальной легочной инфекции Yersinia pestis .Инфекция и иммунитет. 2006. 74 (6): 3381–6. pmid: 16714568
42. 42. Soudja SM, Ruiz AL, Marie JC, Lauvau G. Воспалительные моноциты активируют память CD8 (+) T и врожденные лимфоциты NK независимо от родственного антигена во время инвазии микробных патогенов. Иммунитет. 2012. 37 (3): 549–62. Epub 2012/09/04. pmid: 22940097
43. 43. Lin JS, Kummer LW, Szaba FM, Smiley ST. IL-17 способствует клеточной защите от легочной инфекции Yersinia pestis .J Immunol. 2011; 186 (3): 1675–84. Epub 2010/12/22. pmid: 21172869
44. 44. Литтман Д.Р., Руденский А.Ю. Th27 и регуляторные Т-клетки опосредуют и сдерживают воспаление. Клетка. 2010. 140 (6): 845–58. Epub 2010/03/23. pmid: 20303875
45. 45. МакГичи М.Дж., Бак-Дженсен К.С., Чен Ю., Тато С.М., Блюменшейн В., Маккланахан Т. и др. TGF-бета и IL-6 стимулируют продукцию IL-17 и IL-10 Т-клетками и сдерживают патологию, опосредованную T (H) -17 клетками. Nat Immunol. 2007. 8 (12): 1390–7.Epub 2007/11/13. pmid: 17994024
46. 46. Манц Р.А., Лоннинг М., Кассез Г., Тиль А., Радбрух А. Выживание долгоживущих плазматических клеток не зависит от антигена. Международная иммунология. 1998. 10 (11): 1703–11. pmid: 9846699
47. 47. Фальгрен А., Авикан К., Вестермарк Л., Нордфельт Р., Фаллман М. Колонизация слепой кишки важна для развития стойкой инфекции Yersinia pseudotuberculosis . Заражение иммунной. 2014. 82 (8): 3471–82. pmid: 248
48. 48.Li Z, Li J, Bu X, Liu X, Tankersley CG, Wang C и др. Возрастное увеличение фосфорилирования p38 MAPK в легких мыши. Exp Gerontol. 2011. 46 (8): 694–702. pmid: 21570457
49. 49. Бойд AR, Ориуэла CJ. Нарушение регуляции воспаления как фактор риска пневмонии у пожилых людей. Aging Dis. 2011; 2 (6): 487–500. pmid: 22288022
50. 50. Metzer MI. Экономика планирования и подготовки к биотерроризму. В: Фонг И.В., Алибек К., редакторы. Биотерроризм и инфекционные агенты Новая дилемма 21 века.Нью-Йорк: Springer Sciences + Business Media, Inc .; 2005. с. 237–57.