+8 (916) 786-78-28 с 10.00 до 22.00 ежедневно
+8 (916) 786-78-28 с 10.00 до 22.00 ежедневно
Шпицы – милые собачки, которые славятся своим дружелюбным характером и преданностью владельцу. Они обладают симпатичной внешностью, звонким голосом и довольно высоким интеллектом. Если у вас животное женского пола, полезным будет заранее приготовиться к периоду течки. В это время девочке нужно уделять повышенное внимание, баловать ее и прощать дурное настроение.
Вконтакте
Одноклассники
Мой мир
Течка у собак делится на следующие этапы:
Как правило, течка длится в целом от восемнадцати до двадцати пяти дней, а наступает она дважды в год. Иногда бывает, что перерыв составляет девять месяцев – это нормально, а вот если больше – уже опасно. В этом случае стоит отвести свою четвероногую подругу к ветеринару, чтобы он провел обследование и назначил лечение. Игнорировать подобные вещи нельзя, это чревато онкологией и сбоем в работе гормонов.
Первые месячные у шпицев начинаются в возрасте восьми – двенадцати месяцев.
Можно спросить у заводчика, когда данный процесс начался у матери вашей любимицы, часто сроки совпадают.
В первый раз менструация длится совсем немного времени, выделения при этом скудные и практически незаметные, ведь организм еще не созрел окончательно. Нельзя организовывать вязку в этот период – это очень тяжело переносится, могут развиться различные болезни и опухоли.
К наступлению этого периода можно подготовиться заранее, если знать о симптомах. Вот они:
Милашка начинает активнее выпрашивать пищу, больше есть. Не стоит ее перекармливать, ведь это грозит ожирением;Как только вы заметите все или большинство из этих симптомов, будьте уверены – скоро начнется особый период, в который вашей зверюшке понадобится много внимания, любви и терпения от вас.
Как должен вести себя хороший хозяин в столь сложный период? Все не так сложно, как может показаться неподготовленному человеку. Для начала, помните, что выгуливать красавицу стоит на коротком поводке, а если рядом слишком много других особей мужского пола, то и вовсе не выпускать из дома, а поместить в вольер или приучить к лотку.
Не стоит надеяться, что шпиц послушен и спокоен, во время игр гормонов ничего нельзя предсказать. Кобелей не стоит подпускать даже близко, иначе потом не сможете оттащить.
Следите за сквозняками дома, не выводите самочку в холода на улицу – она сейчас особенно склонна к простудам, иммунитет ослаблен. Не разрешайте ей лежать на холодном, а также купаться – это противопоказано еще и потому, что она может легко заразиться мочеполовой инфекцией. Избегайте открытых водоемов.
Откажитесь от выставок и показов – животное не будет выполнять команды, кроме того, оно может оставить капли крови на полу, что будет не очень удобным. Не сильно балуйте любимицу, иначе потом придется долго ее от этого отучать. Не стоит давать запрещенные лакомства и еду со своего стола, а вот специальные угощения из зоомагазина – можно.
Обзаведитесь специальным бельем, которое поможет защитить мебель и ковры от выделений, а питомицу – от инфекций и покушений самцов. Однако, трусики надевать постоянно не стоит, лучше только в периоды, когда крови особенно много, ведь это мешает естественной самостоятельной гигиене.
Тщательно наблюдайте за дамой, следите, чтобы цикл не нарушался, а если такое происходит, обращайтесь в клинику. Не бросайте все на самотек – это очень опасно, не стоит надеяться на то, что «само рассосется». Шпиц – искусственно выведенная порода, ее представителям нужно много внимания и заботы от человека.
Ни в коем случае не вяжите малышку во время первой течки! Дождитесь третьей или четвертой, этот тот срок, когда ее организм готов к вынашиванию щенят, окреп и вырос. Не стоит производить случку и каждую течку – это очень ослабляет, приводит к болезням и патологиям. Лучше давать отдых и приводить девочку к жениху хотя бы через менструацию, а лучше через две.
К выбору самца нужно подойти ответственно – обязательно узнайте, есть ли у него наследственные заболевания, какая генетика, есть ли подобный опыт.
Опытные женихи намного предпочтительнее, они не стесняются и не тянут время, а сразу приступают к делу. Не стоит выбирать псов, которые вам не нравятся внешне, ведь кутята будут похожи на них. Попросите у заводчика показать документы и убедитесь, что мальчик без дефектов. Если же вы хотите щенков шоу-класса, обращайтесь к медалисту.
Обычно течка длится 2–4 недели. В начале цикла сука может быть невосприимчивой к самцам, хотя некоторые из них восприимчивы на протяжении всего цикла. Он может быть короче или длиннее, и вы поймете, что цикл окончен, когда вся ее вульва вернется к своему нормальному размеру и больше не будет кровотечения или выделений.
Изменения могут варьироваться от довольно легких до более серьезных. Иногда сука становится более ласковой и цепкой по отношению к своему хозяину, иногда она может казаться немного сварливой.
Проэструс: Проэструс — это начало периода течки, когда тело вашей собаки готовится к спариванию. Признаки, наблюдаемые во время этой фазы, включают опухшие вульвы, выделения с оттенком крови, чрезмерное облизывание области гениталий, цепкое поведение и агрессию по отношению к самцам собак. Ваша собака также может держать свой хвост близко к своему телу.
В дополнение к перечисленным выше медицинским преимуществам, поведение суки может значительно улучшиться после стерилизации. Когда собака переходит в течку, гормоны в ее организме меняются.
Примерно через 9-10 дней кровотечение станет более водянистым или остановится. Именно в это время ваша самка, скорее всего, будет наиболее плодовита. Эта стадия проэструса у некоторых собак может длиться до 20 дней. Таким образом, окончание кровотечения может быть более полезным индикатором пика фертильности.
Порода, размер и возраст могут повлиять на продолжительность сезона. Вы узнаете, когда они закончат свой сезон, когда прекратятся кровотечения и выделения. Вы также заметите, что вульва вашей собаки вернется к нормальному размеру и цвету.
Собаки могут забеременеть в самый первый эстральный цикл, что увеличивает вероятность случайного размножения.
youtube.com/embed/NwhmrTL4Sbwu0026t=36s» frameborder=»0″ allow=»accelerometer; autoplay; encrypted-media; gyroscope; picture-in-picture» allowfullscreen=»»/> У самок течка наступает в среднем каждые шесть месяцев. Но это может отличаться, особенно вначале, поэтому неплохо отслеживать. Некоторым собакам может потребоваться 18-24 месяца, чтобы развить регулярный цикл. Маленькие собаки склонны к течке чаще, до трех или четырех раз в год.
Мечение сучек происходит незадолго до охоты и во время охоты. Поведение не характерно для кастрированных или стерилизованных собак. Изменения окружающей среды. Если появится новая собака, местные собаки могут пометить мочу, чтобы обозначить свою территорию.
Обзор. Жара / сезон — это плодородный период цикла собаки, когда она может забеременеть. У собак обычно первая течка бывает в возрасте около 6 месяцев, а затем каждые 6-7 месяцев.
Так следует ли собакам в течку носить подгузники? Абсолютно! Подгузники из меховой одежды для ребенка, помогающие справиться с тепловым циклом, должны стать для вас прекрасным опытом. Обязательно внимательно следите за своей собакой, ищите эти признаки и уделяйте ей больше внимания и любви.
Эстральный (репродуктивный) цикл собак состоит из 4 различных стадий. Это проэструс, течка, диэструс и анэструс.
Выводы
Стерилизация во время жары сопряжена со значительным риском. Если возможно, отложите стерилизацию до завершения цикла нагрева. Стерилизация вашей собаки через 2-3 месяца после течки снизит вероятность кровотечения, упростит операцию и снизит стоимость для вас!
Собаководство — Запуск жары
Мамам тяжело, если вы даете им отдых и периодически разводите их. …Как долго длится цикл течки или течка? Циклы течки различаются, но в среднем у большинства собак составляет две-три недели. Цикл течки начинается с первых признаков отека вульвы или выделений из влагалища. Он заканчивается, когда прекращаются выделения и вульва возвращается к своему нормальному размеру.
Для того, чтобы понять причины появления осложнений у не кастрированных животных, нам надо разобраться в сложном механизме полового цикла у собак и кошек.
С началом проэструса у сук набухают наружные половые органы и появляются кровянистые выделения из половых путей.
Проэструс — это начало течки. В яичниках начинают расти фолликулы под влиянием гонадотропных гормонов — лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего (ФСГ), выделяемых гипофизом. Вслед за пиком концентрации эстрадиола у сук возникает пик концентрации ЛГ и далее через короткий промежуток времени – овуляция. Так как овуляция возникает без каких-либо внешних воздействий – то ее называют спонтанной.
С началом фертильного периода (благоприятного для беременности) у сук начинается эструс. В этот период падает уровень эстрадиола и начинается рост гормона прогестерона. В момент овуляции из фолликулов выходят яйцеклетки, а на месте фолликулов образуются временные железы внутренней секреции – желтые тела. Именно они вырабатывают прогестерон – гормон поддержания беременности. Помним, что овуляция у сук происходит спонтанно, не зависимо от того – была ли вязка или нет. А это значит, что уровень гормонов у повязанной суки, у не повязанной, у беременной и не беременной примерно одинаковый.
После окончания фертильного периода начинается стадия диэструса, в это время прогестерон активно растет, готовит эндометрий для прикрепления эмбрионов, опять же не зависимо от вязки. Прогестерон – очень нужный гормон, но в то же время опасный. Ведь именно в стадию диэструса при высоком уровне прогестерона может развиться такое опасное заболевание, как пиометра (дословно переводится, как гной в матке). Примерно с 35 дня диэструса в организме сук начинает вырабатываться гормон пролактин (отвечающий за поведение мамочки и лактацию). Под влиянием высокого прогестерона пролактин не может сильно расти, поэтому он минимален и дожидается окончания стадии диэструса (примерно 70 дней у небеременных и до родов у беременных).
После окончания диэструса прогестерон падает до базального уровня, а пролактин начинает свою работу, вызывая у родивших собак – материнский инстинкт, а у не беременных – ложную щенность.
Этот период называется анэструсом, самое начало анэструса выпадает на пролактиновую активность, а далее пролактин снижается и собака живет на нулевых уровнях половых гормонов до следующей течки.
Зная изменения гормонального фона, можем сделать выводы:
Когда световой день увеличивается, кошка начинает входить в проэструс (начало течки) с определенным интервалом (примерно каждые 14-30 дней), кричит, метит территорию.
Это будет продолжаться до вязки с котом, а значит произойдет овуляция и кошечка войдет в период диэструса (рост прогестерона и эндометрия), как и собака.
Но, бывают ситуации, когда владельцы провоцируют спонтанную овуляцию у кошки — почесывание крупа и холки во время течки, вязка с кастратом и прочие виды стимуляции. Такие случаи не часты, но заканчиваются ложной беременностью и, иногда, пиометрой.
Итак,что же мы можем сказать про кошек:
ФАМ возникает при высоком уровне прогестерона.Течка, овуляция, беременность, роды, лактация — сложные биологические процессы в организме, управляемые гормонами. Помните, что животные стремятся к продолжению рода только вследствие инстинкта, а не желания «стать матерью». В этой статье мы не коснулись осложнений, которые могут возникать во время беременности и родов, т.к. это отдельная тема для обсуждения.
В ваших руках уберечь вашу девочку от нежелательных последствий половых циклов и дать ей долгую, здоровую, счастливую жизнь!Здоровья вам и вашим питомцам!
Ветеринарный врач репродуктолог-неонатолог МВЦ «ПиК»
Борисова Мария Сергеевна
Делиться заботой!
Независимо от того, купили ли вы померанского шпица у авторитетного заводчика или усыновили своего очаровательного пса, самое важное решение, которое необходимо принять, — это когда стерилизовать члена вашей семьи.
Мне совершенно не нравилась идея кастрировать моего первого померанского шпица, но меня утешал тот факт, что в результате этого он проживет более долгую и здоровую жизнь.
За прошедшие годы появилось множество мифов, связанных с репродуктивными потребностями померанских шпицев.Основные мифы заключаются в том, что мужчины становятся неженками; в то время как стерилизованные самки становятся толстыми.
Самцы померанского шпица, особенно обладающие доминирующим характером, как правило, являются гораздо лучшими домашними животными. Они меньше бродят и реже метят свою территорию (включая всю мебель). Если вы кастрируете свою собаку до того, как она станет взрослой, ее желание навязать свою доминирующую личность над членами семьи станет менее частым.
В целом ваш шпиц будет здоровее, а поскольку он кастрирован, риск рака яичек у него будет равен нулю.
** Важное примечание : Если вы кастрируете своего шпица, он будет производить гораздо меньше тестостерона, но гормон не будет устранен полностью.
Таким образом, любая собака, которая была кастрирована, особенно если ее характер скорее доминантный, все еще может бродить и быть напористой или агрессивной.
Многие владельцы сильно полагаются на процесс стерилизации, чтобы исправить проблемы с поведением своих собак. Однако они должны приучить свою собаку вести себя одинаково, независимо от того, находится ли она на публике или дома, поэтому они не могут лениться.
Самки с большей вероятностью станут лучшими домашними животными, если у них не будет течки (или эструса/цикла течки) регулярно каждые 6-9 месяцев. Такие циклы приносят гормональные изменения, которые могут привести к изменениям личности. Самки, которые испытывают эту течку, должны быть помещены в карантин, чтобы избежать беременности. По мере того, как самки становятся старше, их циклы течки могут вызывать в их репродуктивной системе рак молочной железы и матки.
У некоторых девочек-шпицев могут быть ложные беременности, с которыми неприятно справляться, а также инфекции в их матке, которые могут оказаться смертельными.
Несмотря на изменения в гормонах, вызванные стерилизацией и избыточным весом, суки и кобели обычно не толстеют только потому, что их кастрировали или стерилизовали.
Подобно другим млекопитающим, они набирают вес из-за того, что мало двигаются, слишком много едят или запрограммированы на избыточный вес.
Любая прибавка в весе после хирургической стерилизации может быть связана с гормональными изменениями. Тем не менее, проблема усугубится, если вы продолжите кормить свою собаку диетой с высоким содержанием энергии, в то время как ей не нужно столько энергии, потому что она достигла своего правильного взрослого размера.Если в его еде есть лишняя энергия, она превращается в избыточное количество жира на его теле.
Померанский щенок” src=»https://pomeranian.org/wp-content/uploads/2019/07/pomeranianpuppy6.jpg» alt=»Померанский щенок» class=»wp-image-10410″/>Померанский щенок
Это потому, что он гораздо реже страдает от болезней и инфекций, таких как рак простаты, и смертельных состояний, включая рак яичек.Если он не прошел процедуру, и вы вовремя не заметите, что у него есть проблемы, чтобы его лечил ветеринар, он может лишиться жизни.
Нестерилизованные самки померанского шпица подвержены риску рака молочной железы и других опухолей.
Это означает, что их намного легче дрессировать, и они будут лучше себя вести вне дома. Многие собаки пытаются сбежать, потому что у них есть желание спариться, и пока ваша не будет стерилизована, он будет одной из них. Однако, если он исчезнет из вашего поля зрения на секунду, он может пораниться, потому что он может быть быстрым.Бегать перед автомобилем или грузовиком так просто и занимает некоторое время. Кастрируйте своего померанского шпица, и вы защитите его, потому что он не почувствует желания сбежать и бродить по окрестностям. Вам не нужно беспокоиться о том, что он сделает именно это.
Бродячие животные могут размножаться и производить потомство, о котором они не могут заботиться.Щенки подвергаются воздействию мира и уязвимы для болезней и несчастных случаев, а также легко теряют свою жизнь. Та же история и со взрослыми бродягами. Стерилизация — это безопасный и умный способ ухода за ним.Если вы не являетесь зарегистрированным заводчиком, вам нужно хорошо подумать, прежде чем браться за разведение своего померанского шпица. Известно, что померанских шпицев трудно разводить, и опытные заводчики называют их породой с разбитым сердцем.
Факты о померанских кастратах Пусть ваш ветеринар будет проводником, потому что все собаки разные. Возраст, пол и здоровье являются основными факторами, определяющими, когда лучше всего стерилизовать померанского шпица. Помпоны обычно нужно делать в возрасте от 5 до 9 месяцев. Ваш померанский шпиц должен быть кастрирован в период полового созревания, если это возможно.
Стерилизация самки померанского шпица называется стерилизацией, и эта операция немного более инвазивна и сложна, чем процедура для кобеля.Владельцам щенков померанского шпица лучше всего спросить своего ветеринара, когда стерилизовать щенка померанского шпица.
Возможны осложнения, но они редки. К более частым осложнениям относятся:
Стерилизация померанского шпица дает ряд положительных результатов, направленных на улучшение общего состояния здоровья. Он защищен от ряда потенциально смертельных болезней, а также помогает шпицам прожить более долгую жизнь.
Обычно его поведение значительно улучшается. Как и везде, осложнения могут быть, но редко.
Отказ от ответственности : Содержимое не предназначено для замены профессионального ветеринарного совета, диагностики или лечения.Всегда обращайтесь за консультацией к ветеринару по любым вопросам, которые могут у вас возникнуть относительно состояния здоровья вашей собаки. Никогда не пренебрегайте профессиональным советом и не откладывайте его поиск из-за чего-то, что вы прочитали на ЛЮБОМ веб-сайте.
Авторское право Pomeranian.org. Все права защищены.
Ссылки и дополнительная литература:
Официальный стандарт поморского шпица (AKC). Американский клуб собаководства, 2011 г.
Стандарт породы померанского шпица Английского клуба собаководства, 2017 г.
Дениз Лео, Справочник померанского шпица.
Почти 50 лет назад дрессировщик цирка Калеб Томпсон совершил поездку по США и Канаде с двумя представлениями животных, в которых участвовали только белые лошади и маленькие белые собаки.
Он разводил, выращивал и дрессировал животных на своем ранчо Белой Лошади в Небраске и основал там школу для обучения верховой езде и дрессировке животных.
Породой собак, представленных в его трюках с животными, был американский эскимос, шпиц с запутанной и яркой историей. Внешне типично северная собака, яркий, привлекательный темперамент, мастерство и белоснежная шерсть американского эскимоса сделали его любимцем цирковой публики, ездил ли он в повозке, запряженной другими собаками, сам тянул маленькую тележку, ездил верхом или выполнял трюки. множество других подвигов.Цирки по большей части ушли на второй план, но Эски по-прежнему занимается своей торговлей в гостиных по всей стране, радуя владельцев и друзей своими розыгрышами и способностями.
«Шпиц» — это тип собак с заостренной мордой, заостренными ушами и закрученным хвостом, а не порода собак в большей степени, чем «гончая» или «спаниель». Собаки в семействе шпицев, также известные как северные собаки, включают акиту, норвежского элкхаунда, чау-чау, финского шпица, померанского шпица и кеесхонда.
Последние две породы тесно связаны с американскими эскимосами, поскольку все три произошли от семейства немецких пород шпиц, различающихся по размеру и окрасу.
Вольфшпиц волчье-серого цвета, самый крупный в группе, его рост составляет 18 дюймов. Эта порода, вероятно, является прародительницей кеесхонда, бойкой голландской собаки, которая была любимицей рабочего класса в низинах. (См. профиль кеесхонда, «Руководство для владельцев собак», июнь 1993 г.) Остальные породы в группе бывают нескольких цветов и различаются по размеру следующим образом: крупный шпиц или гигантский шпиц имеет рост 16 дюймов; Миттельшпиц или стандартный шпиц 11-14 дюймов в высоту; Кляйншпицу или маленькому шпицу 8 лет.от 5 до 11 дюймов в высоту; а цвергшпиц или карликовый шпиц, ставший в США померанским шпицем, имеет рост менее 8,5 дюймов.
Различные типы шпицев попали в США с немецкими иммигрантами в конце 19-го и начале 20-го веков, но фактическое развитие американских эскимосов как белой породы шпицев утеряно, потому что до 1969 года не существовало породного клуба для ведения письменных записей.
Однако нет никаких сомнений в том, что порода пришла из Германии, а не является «миниатюрным самоедом», как утверждают некоторые.
«Американская эскимосская собака» стала официальным названием породы во время Первой мировой войны, когда ссылка на Германию считалась анафемой в союзных нациях. В Англии немецкая овчарка стала овчаркой; в этой стране американский шпиц стал американской эскимосской собакой.
Американская эскимосская собака зарегистрирована в Объединенном клубе собаководства и 1 июля 1995 года была принята в неспортивную группу Американского клуба собаководства, став 138-й породой АКС.Есть два национальных клуба породы: Национальная американская ассоциация эскимосских собак и Американские эскимосские собаки Америки.
Стандарты породы отличаются словами, но не описанием породы. Основное отличие состоит в том, что UKC распознает только стандартные и миниатюрные размеры, а AKC добавит размер игрушки. Американская эскимосская собака имеет типичную северную собачью внешность: стройное тело, двойная шерсть, заостренная морда, маленькие глаза, треугольные уши с закругленными кончиками, закрученный хвост и плавная, устойчивая походка.
Хотя эски разводят в основном как компаньона, он выглядит как ездовая собака и чувствует себя как дома в снегу, на льду и при низких температурах.
Белый цвет является предпочтительным, хотя допускаются бисквитные или кремовые отметины. Корпус собаки должен быть крепким и компактным, с хорошо изогнутыми ребрами, глубокой грудью, прямой, мускулистой спиной и поясницей. Как и у других скандинавских собак, лапы должны быть плотно сжаты с жесткими подушечками. Хвост покрыт длинными волосами и перекинут через спину собаки; тугой или двойной завиток, который часто наблюдается у акитов, является недостатком эски.
Шерсть у самцов более пышная, чем у самок. Он самый густой в гриве вокруг шеи и совершенно свободен от волн или завитков. Подшерсток очень густой и мягкий, и при линьке по воздуху разлетаются пучки белого цвета, снуют по полу и забиваются под мебель. Верхний слой длиннее и жестче и образует слой защиты от непогоды.
Самцы эски стандартного размера 15-19 дюймов, самки 14-18 дюймов.
Миниатюрные самцы имеют рост 12-15 дюймов, а миниатюрные самки — 11-14 дюймов.В классах щенков миниатюры имеют минимальную высоту 11 дюймов для кобелей и 10 дюймов для сук. Размеры AKC: игрушки от девяти до 12 дюймов; 12-15 дюймов, миниатюры; и 15-19 дюймов для стандартов без разницы для мужчин и женщин.
Дисквалификация породы включает голубые глаза; глухота может быть проблемой у голубоглазых белых собак.
Американский эскимос — сообразительная, бдительная, умная собака, которая всегда готова охранять свою семью, когда это необходимо.Собака имеет высокий уровень энергии и может быть шумной или разрушительной, если ей не давать достаточно времени. Хорошо воспитанный эски — прекрасная городская собака, если он получает ежедневную прогулку. Его удовольствие от человеческого общества, его владельца и других, а также его склонность к обучению трюкам и играм делают его прекрасным компаньоном для умеренно активной семьи.
Эски любят хорошо воспитанных детей и считаются хорошей породой для начинающих владельцев собак, если приобретаются у надежного заводчика.
Однако, к сожалению, порода пострадала от рук щенячьих ферм и невежественных заводчиков на заднем дворе, и многие из них разводятся без учета темперамента.Плохо воспитанный эски может быть раздражительным и нервным, тявкающим или болезненно застенчивым.
Шерсть эскимосов необходимо расчесывать пару раз в неделю, чтобы предотвратить колтуны и колтуны, особенно вокруг ушей и хвоста. Щетка с тупыми иглами подходит для регулярной чистки; грабли коврика будут необходимы, если шерсть будет запутываться. Эскии обильно линяют не реже одного раза в год. Нестерилизованные суки могут линять после каждой течки, а самки сбрасывают шерсть после вынашивания помета.
Эски — порода-долгожитель, у которой мало выявленных проблем, но, поскольку заводчики проводят мало генетических тестов, частота наследственных заболеваний может быть выше, чем предполагается в настоящее время.Несмотря на то, что порода имеет размер от малого до среднего, племенное поголовье следует обследовать на дисплазию тазобедренного сустава.
Камни в мочевыводящих путях могут быть проблемой, как и аллергия на блох.
Эски нужно обучать, и это обучение должно проводиться с добротой и последовательностью. Порода не прощает суровых методов и может превратиться в сжимающуюся фиалку или нарушителя спокойствия, если с ней не обращаться справедливо и жестко. Многие американские эскимосы преуспели в испытаниях на послушание UKC, и собака является фаворитом в актах животных.Теперь, когда AKC одобрила их включение в разную группу, они также начнут участвовать в испытаниях AKC.
Развитие и гибель желтого тела (ЖТ) сопровождаются ангиогенными и ангиорегрессивными процессами; однако медиаторы этих процессов до конца не идентифицированы и не охарактеризованы.
Исследования по профилированию транскрипции выявили повышенную регуляцию богатого цистеином 61 (CYR61) в CL, о чем ранее ничего не было известно. В настоящем исследовании мы обнаружили, что в течение 12-часового периода после однократной инъекции простагландина F 2альфа (PGF 2альфа ) ОТ-ПЦР выявила активацию CYR61 через 0,5 и 1 ч, после чего отклоненный. Мы также определили, что эндотелиальные клетки лютеинового происхождения, а также лютеиновые стероидогенные клетки являются источниками CYR61.Лечение PGF 2альфа in vitro не влияло на экспрессию CYR61 в лютеиновых эндотелиальных клетках, но повышало экспрессию CYR61 в лютеиновых стероидогенных клетках. Во время эстрального цикла уровень CYR61/ CYR61 (транскрипт/белок) повышался на 4-й день, но не на 10-й и 16-й день CL, что позволяет предположить, что это может быть связано с переключением на ангиогенный фенотип. Кроме того, специфическая, но преходящая активация CYR61 с помощью PGF 2альфа in vivo и в лютеиновых стероидогенных клетках, но не в эндотелиальных клетках in vitro, может быть частью механизма, лежащего в основе ранее описанного преходящего увеличения кровотока во время ранней начало лютеолиза.
Это подтверждается нашими предварительными данными о том, что CYR61 временно ингибирует экспрессию эндотелиальными клетками мРНК эндотелинпревращающего фермента 1, но не эндотелина 1. В совокупности повышенная экспрессия CYR61 на 4-й день CL и ее временное увеличение с помощью PGF 2alpha на 6-й день , 10-й день и 16-й день CL указывают на то, что CYR61 может играть роль в регуляции ангиогенеза на протяжении всей жизни CL.
Несмотря на то, что он является отличительной чертой различных патологий человека, ангиогенез редко происходит в нормальных условиях.Единственным исключением из этого правила является женская репродуктивная система. Мы и другие [1-3] ранее предположили, что желтое тело (ЖТ), эфемерная железа яичника, может быть полезной моделью для изучения механизмов, лежащих в основе индукции ангиогенеза и регрессии ангиогенеза во время репродуктивного цикла. Разрушение базальной мембраны, которая ранее разделяла фолликулярные гранулезные и тека-клетки, начинается после выброса овуляторного гонадотропина [4, 5].
Кроме того, эндотелиальные клетки внутренней теки пролиферируют и мигрируют через разрушенную базальную мембрану, образуя новые капиллярные сосуды в гранулезном слое [4, 6, 7].В результате последний претерпевает поразительный переход от аваскулярного к сосудистому компартменту, как показано у крысы [5] и у кролика [8], очень похоже на «переключение» на ангиогенный фенотип, происходящее при опухолевой прогрессии. 9, 10]. Этот ангиогенный переключатель обеспечивает кровоснабжение дифференцированных стероидогенных клеток КЛ кролика и крысы [8, 11]. и он инициирует образование и развитие лютеиновой кислоты на ранних стадиях эстрального цикла у коровы [1]. В середине цикла постоянный ангиогенез или ангиоподдержание необходимы для поддержания повышенного стероидогенеза CL [12, 13], одной из наиболее васкуляризированных тканей в организме, как показано на примере коровы [14].В конце эстрального цикла ингибирование ангиогенеза наряду с регрессией ранее существовавших кровеносных сосудов сопровождает функциональную и структурную гибель CL [15, 16].
Таким образом, развитие, функция и отмирание CL тесно связаны с ангиогенезом, поддержанием ангио-состояния и ангиорегрессией [17, 18].
Мы и другие авторы [3, 13, 19, 20] использовали модель КЛ для идентификации и изучения паттернов экспрессии молекулярных детерминант, таких как матриксные металлопротеиназы (ММП) и тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП), связанных с ангиогенезом в КЛ млекопитающих. .Ангиогенез представляет собой динамичный и сложный биологический процесс, управляемый множеством ангиогенных факторов. Помимо ММР и их эндогенных ингибиторов, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [21–24], основного фактора роста фибробластов (bFGF; официальное обозначение FGF2) у человека [22] и коровы [25], эндокринной железы-VEGF (EG-VEGF; официальное обозначение PROK1) у человека [26] и ангиопоэтины (ANGPT1 [Ang-1] и ANGPT2 [Ang-2]) [27] изучались в КЛ. Эти ангиогенные факторы демонстрируют различные паттерны экспрессии в течение жизни CL у человека [26], крупного рогатого скота [28] и крысы [27].
Это говорит о том, что различные ангиогенные факторы имеют различные функции во время лютеинового ангиогенеза, поддержания ангионевротического состояния и ангиорегрессии.
В нефертильном цикле ангиогенез наиболее интенсивен в начале развития CL и затем снижается. Когда цикл заканчивается, гораздо меньше известно о механизмах/процессах, связанных с ангиорегрессией при лютеолизе [18]. В рамках нашей текущей инициативы по профилированию молекулярных детерминант, которые включают и выключают ангиогенез в бычьих CL, мы провели исследования профилирования транскрипции на CL, собранном 0.5 ч после инъекции простагландина F 2α (PGF 2α ), естественного лютеолизина у жвачных животных. Мы идентифицировали и подтвердили дифференциальную экспрессию богатого цистеином 61 (CYR61), индуктора ангиогенеза. CYR61 является членом семейства белков фактора роста соединительной ткани/богатого цистеином 61/гиперэкспрессируемого нефробластомы (CCN), которое состоит из сигнальных белков, связанных с внеклеточным матриксом (ECM), включая CYR61, фактор роста соединительной ткани (CTGF), гиперэкспрессированный нефробластомой ген и WNT1-индуцированные секретируемые белки (WISP 1, 2 и 3) [29].
CYR61 представляет собой секретируемый, ассоциированный с ECM, гепарин-связывающий белок, который способствует адгезии эндотелиальных клеток, миграции и синтезу ДНК, индуцированному фактором роста (FGF2) [30]. В то время как CTGF был описан в фолликуле свиньи и CL [31], насколько нам известно, сообщений о CYR61 в CL не появлялось. В настоящем исследовании мы исследовали временную регуляцию CYR61 с помощью PGF 2α in vivo и in vitro. Кроме того, мы определили характер экспрессии CYR61 в течение эстрального цикла и его клеточную локализацию при CL быка.
желтых тел собирали у коров на 6, 10 и 16 дни эстрального цикла через 0,5 ч после инъекции PGF 2α или физиологического раствора. Профилирование транскрипции проводили на объединенных CL на 6-й день от коров, получавших PGF 2α , и коров, получавших физиологический раствор.
Активация гена CYR61 была подтверждена полуколичественным анализом RT-PCR каждого CL, собранного, как описано выше.Временную экспрессию гена CYR61 дополнительно определяли путем инъекции коровам на 10-й день PGF 2α и сбора CL через 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 часов после лечения для анализа с помощью ОТ-ПЦР. Кроме того, лютеиновую ткань из CL на 10-й день обрабатывали для иммунофлуоресценции и диссоциировали для исследования экспрессии и регуляции CYR61 in vitro. Для экспериментов in vitro лютеиновые стероидогенные клетки (LSC) и лютеиновые эндотелиальные клетки (LDEC) обрабатывали PGF 2α , а экспрессию транскрипта CYR61 в течение 24 ч определяли с помощью RT-PCR.Кроме того, LDEC обрабатывали рекомбинантным CYR61 для изучения его влияния на систему эндотелина. Наконец, CL на 4, 10 и 16 дни эстрального цикла собирали и анализировали на экспрессию гена CYR61 и белка. Лечение животных и сбор тканей для профилирования транскрипции, экспрессии CYR61 в течение эстрального цикла, культуры LSC и иммунофлуоресценции проводились в Университете Нью-Гэмпшира, тогда как лечение животных и сбор тканей для временной экспрессии CYR61 после инъекции PGF 2α проводились в Университете штата Огайо.
Все анализы образцов, культуры LDEC, а также экспрессию и очистку рекомбинантного CYR61 проводили в Детской больнице Бостона.
Все процедуры с животными в настоящем исследовании проводились в соответствии с протоколами, одобренными комитетами по уходу и использованию животных Университета Нью-Гемпшира и Университета штата Огайо. CL были собраны от цикличных, нелактирующих молочных коров, размещенных в Центре обучения и исследований молочной промышленности Fairchild Университета Нью-Гэмпшира и в молочном центре Krauss в Центре сельскохозяйственных исследований и разработок штата Огайо с использованием ранее описанных процедур [32, 33].Чтобы профилировать экспрессию генов во время раннего начала лютеиновой регрессии, коровам внутримышечно вводили PGF 2α (25 мг) или физиологический раствор (контроль) на 6, 10 или 16 день эстрального цикла (день 0 = течка; n = по 3 на каждый этап).
CL собирали через 0,5 ч после инъекции PGF 2α или физиологического раствора и хранили при -80°C до последующего анализа.
Для определения экспрессии CYR61 в течение эстрального цикла собирали CL на 4-й день (ранняя стадия; n = 3), 10-й день (середина цикла, n = 6) и 16-й день (поздняя стадия; n = 5).На 4-й день CL яичники удаляли кольпотомией у животных под эпидуральной анестезией (2% [мас./об.] мепивакаина гидрохлорида, 0,01 мл/кг массы тела; Upjohn). Затем CL отделяли от стромы яичника. CL на 10 и 16 дни удаляли из яичника путем энуклеации. Кроме того, для дальнейшего определения характера экспрессии временного гена во время лютеиновой регрессии, PGF 2α (25 мг) вводили внутримышечно коровам на 10-й день эстрального цикла, и собирали 0 CL (n = 4 на момент времени).через 5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после обработки.
Чтобы профилировать паттерны экспрессии генов в начале лютеиновой регрессии, общую РНК экстрагировали из объединенных CL, полученных через 0,5 часа после инъекции PGF 2α коровам на 6-й день эстрального цикла.
Анализ профиля гена был выполнен в Центре Microarray Core Facility Детской больницы Бостона. Вкратце, кДНК синтезировали из РНК, а затем транскрибировали в РНК, меченную биотином, перед процессингом и гибридизацией на массиве зондов Affymetrix GeneChip U133A.После сканирования профили гибридизации между контрольными образцами, которым вводили физиологический раствор на 6-й день, и образцами лютеина, обработанными PGF 2α , затем анализировали с использованием программного обеспечения Affymetrix Suit. Затем для дальнейшей проверки и анализа отбирали гены с экспрессией, которая демонстрировала по меньшей мере двукратное отличие от контроля.
желтых тела (n = 4) были собраны у коров на 10-й день эстрального цикла. LSC диссоциировали, как описано ранее [34].Вкратце, лютеиновые ткани измельчали перед помещением во вращающуюся колбу, содержащую 25 мл Ham F-12 с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и коллагеназой типа I (2000 ед/г ткани; Worthington Biochemical) на 1 ч при 37°C.
. В течение этого периода ткани растирали каждые 10 мин. Через 1 ч диссоциированные клетки последовательно центрифугировали при 190× g , 110× g и 80× g для удаления коллагеназы, соединительной ткани и других остатков тканей. Жизнеспособность и количество клеток определяли по исключению трипанового синего и подсчету с помощью гемоцитометра соответственно.
Лютеиновые стероидогенные клетки высевали в шестилуночные планшеты (4 × 10 5 клеток/лунку), содержащие 2 мл культуральной среды Ham F-12 с добавлением инсулина/селена/трансферрина (5 мкг/5 мкг/5 нг/л). мл; Sigma) и гентамицин (30 мкг/мл; GIBCO-BRL). После инкубации в течение ночи неприкрепленные клетки удаляли промыванием свежей средой Ham F-12. Затем ЛСК обрабатывали 1 мкМ PGF 2α в течение 0,5, 2, 12 и 24 часов. Клетки подсчитывали до и после обработки в каждый момент времени.Затем клетки обрабатывали для выделения общей РНК в соответствии с методом, описанным в следующем разделе.
Эндотелиальные клетки лютеинового происхождения (любезно предоставленные доктором Бо Руеда, Массачусетская больница общего профиля, Бостон, Массачусетс) выделяли из бычьего CL на 10-й день, как описано ранее [35]. LDEC (пассажи 4–9) высевали в шестилуночные планшеты (1 × 10 5 клеток/лунку) и культивировали в среде для роста эндотелиальных клеток (EBM-2), содержащей факторы роста и 10% фетальной телячьей сыворотки (BioWhittaker, Inc. .) на 2 дня. После голодания в среде EBM-2 без факторов роста и без сыворотки в течение 6 ч клетки обрабатывали 1 мкМ PGF 2α в среде EBM-2 без сыворотки в течение 0,5, 2, 12 и 24 ч, а затем обрабатывали для выделения тотальной РНК в соответствии с методом, описанным в следующем разделе. Для изучения влияния CYR61 на систему эндотелина при КЛ LDEC обрабатывали 10 или 1000 нг/мл CYR61 в течение 1 часа. LDEC из трех разных пассажей использовали для проведения трех повторных экспериментов, а затем из клеток экстрагировали общую РНК для анализа ОТ-ПЦР.
Тотальную РНК выделяли из лютеиновой ткани или из культивируемых лютеиновых стероидогенных и эндотелиальных клеток с использованием спиновых колонок RNeasy (Qiagen). Один микрограмм тотальной РНК подвергали обратной транскрипции в первую цепь кДНК с использованием супертранскриптазы III (Invitrogen). ПЦР проводили с использованием праймеров для обнаружения CYR61 (прямой, 5′-AAGACCCACAGGAGGAGAAG-3′; обратный, 5′-CCACAGCATCCAGGT TATCAG-3′), эндотелина 1 ( EDN1 ; прямой, 5′-TGCCAAGCAGGAAAAGAACT-3′; обратный, 5′-GTGGACGAGGAGCTTCAGAC-3′), и эндотелинпревращающий фермент 1 ( ECE1 ; прямой, 5′-ACACAACCAAGCCATCATCA-3′; обратный, 5′-CAGGGTGTCCTGGAAGTTGT-3′) с «горячим стартом» при 94° C в течение 3 мин, затем 28 циклов: 94°C в течение 30 с, 54°C в течение 30 с и 72°C в течение 30 с.Глицеральдегидфосфатдегидрогеназа крупного рогатого скота ( GAPDH ; прямой 5′-TGTTCCAGTATGATTCCACCC-3′; обратный 5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′) использовали в качестве внутреннего контроля.
Продукты ПЦР фракционировали на 3% агарозных гелях, а интенсивность полос ПЦР определяли с помощью автоматизированной системы оцифровки геля UN-SCAN-IT (Silk Scientific Corporation). CYR61 , EDN1 и ECE1 выражали как отношение их индивидуальных интенсивностей к GAPDH .
Общий белок экстрагировали из лютеиновой ткани и лютеиновых стероидогенных и эндотелиальных клеток, как описано ранее [19, 20], и равные количества белков подвергали вестерн-блоттингу. Белки разделяли на 4–12% SDS-PAGE в восстановительных условиях, а затем электрофоретически переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Invitrogen). Сайты неспецифического связывания блокировали путем инкубации мембран с 5% (масса/объем) обезжиренного сухого молока в буфере TBST (10 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl и 0.05% [об./об.] Тритон Х-100; рН 8,0). Затем мембраны инкубировали с кроличьим антителом против человеческого CYR61 (1:250; Abcam).
После обширных промывок буфером TBST (пять раз по 15 мин на промывку) на мембраны в качестве вторичного антитела наносили антикроличьи иммуноглобулины (Ig) G, конъюгированные с пероксидазой хрена (1:10 000). Сигналы регистрировали с помощью хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico (Pierce) в соответствии с инструкциями производителя. В качестве положительного контроля использовали человеческий рекомбинантный белок CYR61, экспрессированный из клеточной системы Baculovirus-sf9.
среза (толщина 6 мкм) из КЛ 4-го, 10-го и 16-го дня, замороженных в ОКТ (Sakura Finetek) с использованием криотома (Shandon). Срезы фиксировали в холодном ацетоне в течение 5 мин. Неспецифические сайты блокировали 10% (масса/объем) BSA перед инкубацией предметных стекол с мышиным антителом против человеческого CYR61 (1:25; Abcam), за которым следовала инкубация с конъюгированным с Alexa Fluor 594 козьим антимышиным вторичным антителом IgG.
(Молекулярные зонды). LSC идентифицировали путем окрашивания кроличьим антителом против крысиного фермента расщепления боковой цепи цитохрома p450 (SCC) (1:200; Chemicon).Предметные стекла визуализировали после инкубации с конъюгированным с Alexa Fluor 488 козьим антителом против кроличьего IgG (Molecular Probes). Для каждого образца ткани в качестве отрицательного контроля использовали последовательный срез, помещенный на одно и то же предметное стекло и разграниченный путем обведения с помощью гидрофобной барьерной ручки, с заменой первичного антитела IgG.
Мы использовали человеческий рекомбинантный CYR61 для дальнейшего изучения регулирующего действия этого белка на эндотелиальные клетки.кДНК CYR61 человека (щедрый подарок доктора Лестера Лау, Иллинойский университет в Чикагском медицинском колледже) сливали с 6-кратной HIS-меткой на С-конце, а затем вставляли в вектор переноса бакуловируса pVL1393.
Рекомбинантный бакуловирус был создан путем совместной трансфекции рекомбинантного вектора переноса и ДНК BaculoGold в клетки sf9 в соответствии с инструкциями производителя (BD Pharminogen). Рекомбинантный белок CYR61 экспрессировался монослойными клетками sf9 в течение 4 дней после инфицирования. Затем кондиционированную среду пропускали через колонку с Ni-NTA Agarose (Qiagen).Очищенный белок CYR61 был подтвержден анализом SDS-PAGE и вестерн-блоттингом (данные не показаны). Для исследования регулирующего действия CYR61 на эндотелиальные клетки рекомбинантный белок CYR61 (10 или 1000 нг/мл) инкубировали с LDEC в течение 1 часа.
Денситометрическая интенсивность полос на гелях для ПЦР и Вестерн-блотов определялась с использованием автоматической системы оцифровки геля UN-SCAN-IT. Затем данные были проанализированы с помощью ANOVA с последующим тестом попарных сравнений Тьюки для определения различий между группами.
Чтобы охарактеризовать экспрессию генов во время раннего начала лютеиновой регрессии, мы вводили PGF 2α коровам на 6-й день эстрального цикла. ХЛ собирали через 0,5 ч. Профилирование экспрессии генов было выполнено с использованием Affymetrix GeneChip U133A. Те гены с изменениями более чем в 2 раза были отобраны для дальнейшей проверки и характеристики.Среди 50 дифференциально экспрессируемых генов CYR61 , богатый цистеином индуктор ангиогенеза, был увеличен в 2,4 раза, что было подтверждено ОТ-ПЦР (фиг. 1А). Этот ген представлял значительный интерес из-за его прямой связи с ангиогенезом. На 10-й и 16-й день CL PGF 2α также значительно стимулировал ( P <0,01) экспрессию CYR61 по сравнению с их соответствующими одновременными инъекциями физиологического раствора (рис.
1B).
Рис.1
Стимуляция экспрессии CYR61 во время раннего начала лютеиновой регрессии. A ) Репрезентативные полуколичественные результаты RT-PCR из CL, собранные через 0,5 часа после введения PGF 2α (P) или физиологического раствора (S; контроль) коровам на 6-й день (d6), 10-й день (d10) и 16-й день ( г16) эстрального цикла. Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в CL, собранном у всех животных (n = 3 на каждой стадии; светлая полоса, физиологический раствор; черная полоса, PGF 2α ).Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** Р < 0,01.
Рис. 1
Стимуляция экспрессии CYR61 во время раннего начала лютеиновой регрессии. A ) Репрезентативные полуколичественные результаты RT-PCR из CL, собранные через 0,5 часа после введения PGF 2α (P) или физиологического раствора (S; контроль) коровам на 6-й день (d6), 10-й день (d10) и 16-й день ( г16) эстрального цикла.
Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в CL, собранном у всех животных (n = 3 на каждой стадии; светлая полоса, физиологический раствор; черная полоса, PGF 2α ).Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** Р < 0,01.
Для дальнейшего определения временной экспрессии CYR61 во время лютеиновой регрессии CL собирали через 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 ч после введения PGF 2α на 10-й день эстрального цикла. Подобно анализу генного микрочипа, мРНК CYR61 была резко увеличена ( P <0.05) относительно необработанных контролей через 0,5 и 1 ч после PGF 2α (рис. 2). CYR61 затем снизился и был значительно снижен ( P <0,05) через 8 и 12 ч (рис.
2).
Рис. 2
Временная экспрессия CYR61 во время индуцированной PGF 2α лютеиновой регрессии in vivo. A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР в середине цикла, 10-й день CL, собранный через 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 часов после PGF 2α .Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в КЛ, собранных у всех животных (n = 4 для каждой временной точки). Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * Р < 0,05.
Рис. 2
Временная экспрессия CYR61 во время индуцированной PGF 2α лютеиновой регрессии in vivo. A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР в середине цикла, 10-й день CL, собранный через 0,5, 1, 2, 4, 8 и 12 часов после PGF 2α .Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в КЛ, собранных у всех животных (n = 4 для каждой временной точки).
Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * Р < 0,05.
Чтобы идентифицировать клеточный источник (источники) экспрессии CYR61, срезы тканей дважды окрашивали антителом CYR61 и ферментом цитохрома p450 SCC, маркером стероидогенных клеток, соответственно.Двойное окрашивание фермента CYR61 и p450 SCC проводили в середине цикла, на 10-й день CL (рис. 3, A и B), время, когда биосинтез прогестерона очень высок. Совместная локализация фермента CYR61 и цитохрома p450 SCC указывает на то, что LSCs являются источником CYR61 (Fig. 3C).
Рис. 3
Иммунофлуоресцентное окрашивание белка CYR61 и фермента цитохрома p450 SCC (p450SCC) в середине цикла 10-й день крупного рогатого скота CL. Замороженные срезы CL в середине цикла на 10-й день исследовали с помощью антител к ферменту CYR61 ( A ) и ферменту p450SSC ( B ).
Ядра контрастировали 4′,6′-диамидино-2-фенилиндолом. Наложение окрашивания CYR61 и p450SSC показано в C . Репрезентативное изображение аутофлуоресценции показано в D , которое было получено с самым высоким временем экспозиции среди трех используемых настроек фильтра. E и F представляют собой репрезентативные изображения, окрашенные вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 594 и Alexa Fluor 488, соответственно. Исходное увеличение ×20; бар = 100 мкм.
Рис.3
Иммунофлуоресцентное окрашивание белка CYR61 и фермента цитохрома p450 SCC (p450SCC) в середине цикла 10-й день крупного рогатого скота CL. Замороженные срезы CL в середине цикла на 10-й день исследовали с помощью антител к ферменту CYR61 ( A ) и ферменту p450SSC ( B ). Ядра контрастировали 4′,6′-диамидино-2-фенилиндолом. Наложение окрашивания CYR61 и p450SSC показано в C . Репрезентативное изображение аутофлуоресценции показано в D , которое было получено с самым высоким временем экспозиции среди трех используемых настроек фильтра.
E и F представляют собой репрезентативные изображения, окрашенные вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor 594 и Alexa Fluor 488, соответственно. Исходное увеличение ×20; бар = 100 мкм.
Для изучения регуляции экспрессии CYR61 PGF 2α in vitro были выделены лютеиновые стероидогенные и эндотелиальные клетки и обработаны PGF 2α for 0.5, 2, 12 и 24 ч. Хотя PGF 2α не оказывал влияния ( P > 0,05) на экспрессию CYR61 в LDEC (рис. 4, B и C), он значительно стимулировал транскрипт CYR61 в LSC через 0,5 и 2 ч после обработки (рис. 4, А и С). Этот временной регулирующий эффект PGF 2α на CYR61 в LSC аналогичен его профилю экспрессии in vivo во время лютеиновой регрессии, что позволяет предположить, что LSC, а не эндотелиальные клетки, были основной клеточной популяцией в CL, вносящей вклад в PGF .
2α -индуцированное увеличение экспрессии CYR61 .
Рис. 4
Регуляция CYR61 с помощью PGF 2α в лютеиновых стероидогенных ( A ) и эндотелиальных ( B ) клетках in vitro. LSC ( A ) из середины цикла 10-го дня CL (n = 4) и LDEC ( B ) инкубировали без (0 ч) или с 1 мкМ PGF 2α в течение 0,5, 2, 12 и 24 ч. Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. C ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в LSC (светлая полоса) и LDEC (черная полоса) после обработки PGF 2α .Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** P <0,01 по сравнению с 0-часовым контролем. Рисунок 4 LSC ( A ) из середины цикла 10-го дня CL (n = 4) и LDEC ( B ) инкубировали без (0 ч) или с 1 мкМ PGF 2α в течение 0,5, 2, 12 и 24 ч. Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки.
C ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH в LSC (светлая полоса) и LDEC (черная полоса) после обработки PGF 2α .Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** P <0,01 по сравнению с 0-часовым контролем.
В течение эстрального цикла CL подвергается ангиогенезу, ангиоподдержанию и ангиорегрессии. Мы продемонстрировали, что транскрипт CYR61 был высоко экспрессирован на ранней стадии, молодой, развивающейся 4-й день CL, но был резко снижен ( P <0,01) на 10-й и 16-й день CL (рис.5). Подобно другим ангиогенным факторам (например, VEGF и FGF), CYR61 представляет собой секретируемый белок, связанный с ЕСМ. Используя экстракты общего белка из лютеиновой ткани, вестерн-блот-анализ выявил CYR61-иммунореактивный белок (рис. 6А), который показал самую высокую ( P <0,05) концентрацию на 4-й день CL и меньшую на 10-й и 16-й день CL.
(рис. 6Б).
Рис. 5
Экспрессия мРНК CYR61 в бычьих CL во время эстрального цикла. A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL эстрального цикла. Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL. Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** Р < 0,01.
Рис. 5
Экспрессия мРНК CYR61 в бычьих CL во время эстрального цикла. A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL эстрального цикла. Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ CYR61/GAPDH на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL.
Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; ** Р < 0,01.
Рис. 6
Экспрессия белка CYR61 в CL быка во время эстрального цикла. A ) Репрезентативный иммуноблот, показывающий обнаружение белка CYR61 массой около 40 кДа (стрелка) на 4-й день (d4), 10-й день (d10) и 16-й день (d16) CL (M = M r × 10 -3 ; молекулярная масса [относительная молекулярная масса; M r × 10 -3 ]). B ) Денситометрический анализ CYR61 на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL. Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * Р < 0,05.
Рис.6
Экспрессия белка CYR61 в CL быка во время эстрального цикла. A ) Репрезентативный иммуноблот, показывающий обнаружение белка CYR61 массой около 40 кДа (стрелка) на 4-й день (d4), 10-й день (d10) и 16-й день (d16) CL (M = M r × 10 -3 ; молекулярная масса [относительная молекулярная масса; M r × 10 -3 ]).
B ) Денситометрический анализ CYR61 на 4-й день (d4; n = 3), 10-й день (d10; n = 6) и 16-й день (d16; n = 5) CL.Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * Р < 0,05.
Поскольку LDEC не реагировали на PGF 2α (по сравнению с CYR61 ), мы исследовали, играет ли CYR61 происхождения LSC возможную роль в лютеиновой регрессии, изучая его влияние на систему эндотелина в LDEC. Учитывая быструю активацию CYR61 in vivo, LDEC обрабатывали 10 или 1000 нг/мл CYR61 в течение 1 часа.Анализ с помощью RT-PCR показал, что ни одна концентрация CYR61 не влияла на экспрессию EDN1 (фиг. 7). Однако экспрессия ECE1 снижалась ( P <0,05) при более высокой, но не при более низкой концентрации CYR61 (рис. 7).
Рис. 7
Регуляция системы эндотелина в LDEC с помощью CYR61.
A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР для EDN1 и ECE1 . Эндотелиальные клетки выделяли из CL в середине цикла на 10-й день и инкубировали с 10 или 1000 нг/мл CYR61 в течение 1 часа.Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ Gene/GAPDH ( Gene [ EDN1 ], незакрашенная полоса; ECE1 , черная полоса) в LDEC. Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * P <0,05 по сравнению с контролем.
Рис. 7
Регуляция системы эндотелина в LDEC с помощью CYR61. A ) Репрезентативные результаты полуколичественной ОТ-ПЦР для EDN1 и ECE1 . Эндотелиальные клетки выделяли из CL в середине цикла на 10-й день и инкубировали с 10 или 1000 нг/мл CYR61 в течение 1 часа.Bovine GAPDH был внутренним контролем загрузки. B ) Денситометрический анализ Gene/GAPDH ( Gene [ EDN1 ], незакрашенная полоса; ECE1 , черная полоса) в LDEC.
Столбики погрешностей являются средним значением ± стандартное отклонение; * P <0,05 по сравнению с контролем.
Ангиогенез является отличительной чертой развития и функции КЛ [2]. Он включается во время фолликуло-лютеинового перехода и затем выключается во время ангиорегрессии.Хотя несколько ангиогенных факторов, включая VEGF [22, 27, 28], FGF2 у коровы [14, 25] и PROK1 у человека [26], экспрессируются CL, взаимодействие между ними до конца не изучено. В настоящем исследовании мы идентифицировали CYR61, богатый цистеином индуктор ангиогенеза, в CL крупного рогатого скота и обнаружили, что во время раннего начала лютеиновой регрессии in vivo CYR61 временно стимулировался через 0,5 и 1 ч после введения PGF 2α. , возвращаясь к контрольным концентрациям через 2 часа.После этого CYR61 упали ниже контрольных уровней и оставались на этом уровне в течение периода лечения.
Этот ответ на PGF 2α более быстрый, чем тот, который наблюдается с доброкачественной линией клеток эндометрия человека, в которой мРНК CYR61 увеличивалась через 2 часа после обработки, а не до [36]. Поскольку для завершения лютеолиза у коровы необходимы множественные импульсы PGF 2α [37], мы предполагаем, что CYR61 в качестве гена раннего ответа может играть роль в поддержании целостности кровеносных сосудов, что необходимо для транспортировки клеток. обломков во время раннего начала лютеиновой регрессии.Скорее всего, это достигается в сотрудничестве с FGF1 и FGF2. Немедленный ответ CYR61 через 0,5 ч на PGF 2α с последующим его снижением через 2 ч предшествует экспрессии как FGF1, так и FGF2. В частности, FGF1 и FGF2 увеличиваются позже, чем CYR61 (т. е. между 2 и 12 часами до снижения через 48 часов после введения PGF 2α корове [38]). Поскольку CYR61 работает синергетически с FGF2 для увеличения пролиферации эндотелиальных клеток [39], последовательная экспрессия CYR61 и FGFs во время раннего начала лютеиновой регрессии может способствовать выживанию эндотелиальных клеток и поддержанию сосудистой сети.
Это согласуется с другими исследованиями, показывающими, что КЖ крупного рогатого скота на поздней стадии (18–20-й день) по сравнению с КЖ крупного рогатого скота на ранней (1–4-й день) и средней стадии цикла (5–17-й день) обладает наибольшей ангиогенной активностью. 2, 40]. [41, 42]. Одним из объяснений отсутствия чувствительности к PGF 2α CL крупного рогатого скота моложе 5-го дня может быть отсутствие хорошо развитой сосудистой системы, несмотря на то, что ангиогенез в это время идет с высокой скоростью.Это согласуется с выводами Shirasuna et al. [43], которые сообщили, что распределение капилляров и артериовенозных кровеносных сосудов изменяется у коровы CL между 4-м и 10-м днем. и в середине цикла (дни 5–17) крупного рогатого скота CL. Эта дифференциальная чувствительность не связана с отсутствием рецепторов PGF 2α , потому что высокоаффинные рецепторы PGF 2α экспрессируются КЛ 4-го дня [44].Вместо этого другие исследователи предполагают, что различия в экспрессии путей трансдукции пострецепторного сигнала или регуляторных молекул могут объяснить устойчивость к PGF 2α CL моложе 5-го дня.
Например, экспрессия мРНК стероидогенного острого регуляторного белка (STAR) является снижался в середине цикла (день 11), но не в начале (день 4) CL крупного рогатого скота после обработки PGF 2α in vivo [44]. Напротив, PGF 2α увеличивает выработку прогестерона in vitro в середине цикла (дни 8–12) микродиализированных бычьих CL или диспергированных лютеиновых клеток [45, 46].Кроме того, лечение PGF 2α не увеличивает продукцию простагландинэндопероксидсинтазы 2 и, следовательно, интралютеальную продукцию PGF 2α в 4-й день CL крупного рогатого скота [44], но увеличивает 15-гидроксипростагландиндегидрогеназу, которая расщепляет PGF 2α , в ЦЛ овец на 4-й день [47]. Кроме того, в то время как PGF 2α снижает экспрессию VEGF и FGF2 в среднем цикле 10-го дня крупного рогатого скота, он увеличивает их в 4-й день CL [43]. В совокупности разные пути, по-видимому, регулируют ответы на PGF 2α в начале (4-й день) и в середине цикла CL крупного рогатого скота.
Мы также обнаружили, что LSC и LDEC являются источниками CYR61, но только LSC реагировали на PGF 2α in vitro путем повышения экспрессии CYR61 . Отсутствие ответа бычьих LDEC можно объяснить отсутствием рецепторов PGF 2α [48, 49], хотя другие [50, 51] сообщали, что эти рецепторы присутствуют. Это несоответствие может быть связано с методологическими различиями в обнаружении рецепторов и условиями культивирования или с тем фактом, что субпопуляции микрососудистых эндотелиальных клеток присутствуют в бычьих CL [52].На основании полученных данных мы заключаем, что PGF 2α регулирует CYR61 в стероидогенных, но не в эндотелиальных клетках бычьего КЛ.
Учитывая отсутствие ответа LDEC на PGF 2α , могут существовать перекрестные помехи между LSC и LDEC, в результате чего PGF 2α действует на LSC, активируя CYR61, который, в свою очередь, действует на LDEC. Сходные клеточные взаимодействия в бычьем CL были предложены Townson [53] и Liptak et al.
[54] между иммунными и эндотелиальными клетками.Чтобы проверить нашу гипотезу, мы провели предварительный эксперимент, который показал, что CYR61 снижал экспрессию ECE1 , но не EDN1 , с помощью LDEC. Эндотелин 1 является очень мощным сосудосуживающим средством. Он синтезируется в виде неактивного препроэндотелина, состоящего из 203 аминокислот. После протеолитической обработки препроэндотелина в большой эндотелин он превращается в активный 21-аминокислотный пептид с помощью ECE1 [55, 56]. PGF 2α повышает экспрессию EDN1 in vitro и in vivo [57, 58] у коровы.В то время как эндотелиальные клетки являются основным источником EDN1 , как бычьи лютеиновые стероидогенные, так и эндотелиальные клетки также синтезируют ECE1 [59]. Учитывая наши настоящие и опубликованные ранее результаты, мы предполагаем, что CYR61 может локально регулировать активность EDN1 через ECE1. После PGF 2α , EDN1 секреция эндотелиальными клетками повышается.
В то же время LSCs увеличивают CYR61, который действует на эндотелиальные клетки, снижая экспрессию ECE1. Это приводит к снижению доступности биоактивного EDN1 в эндотелиальном компартменте, что способствует целостности кровеносных сосудов во время раннего начала лютеиновой регрессии и, следовательно, может объяснить наблюдаемое ранее преходящее и острое увеличение лютеинового кровотока у коровы, которое происходит 0.5–2 ч после PGF 2α [60].
Наши данные также показали, что CYR61 /CYR61 был сильно экспрессирован в молодом, развивающемся 4-дневном CL крупного рогатого скота, что согласуется с его функцией в качестве индуктора ангиогенеза. Нокаут гена CYR61 приводит к дефекту бифуркации сосудов и, как следствие, к недостаточной васкуляризации плаценты, вызывая гибель эмбриона [61]. CYR61 способствует адгезии эндотелиальных клеток [62, 63], стимулирует хемотаксис в эндотелиальных клетках микрососудов человека [64] и является мощным стимулятором ангиогенеза in vivo [65].
Другой регулятор ангиогенеза, VEGF, экспрессируется CL быка [28], а CYR61 способен стимулировать экспрессию VEGF [66, 67]. VEGF также активирует CYR61 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека [68]; следовательно, совпадающая экспрессия этих двух мощных ангиогенных факторов вместе с FGF2 может работать синергетически, способствуя высокой скорости ангиогенеза, которая, как известно, происходит во время раннего формирования CL [1]. Поскольку CYR61 и VEGF локализованы в лютеиновых клетках, происходящих из гранулезы, они могут служить хемоаттрактантами для индукции направленной миграции эндотелиальных клеток из тека-слоя в ранее бессосудистую полость разорванного фолликула.Эта миграция через ВКМ осуществляется локально продуцируемыми ММП (например, у коровы [3, 32, 69]), которые облегчают отсоединение эндотелиальных клеток от базальной мембраны.
Подобно VEGF, возможно взаимодействие между CYR61 и FGF2. Хотя CYR61 сам по себе не стимулирует пролиферацию эндотелиальных клеток, он усиливает митогенную активность FGF2 в отношении пролиферации эндотелиальных клеток.
Являясь гепарин-связывающим белком, CYR61 способен вытеснять FGF2 из ВКМ и, следовательно, повышать его локальную биодоступность [39], что приводит к усилению пролиферации эндотелиальных клеток на ранней стадии эстрального цикла.
Таким образом, мы идентифицировали CYR61 как потенциальный молекулярный медиатор ангиогенеза в CL. Лютеиновые стероидогенные и эндотелиальные клетки являются источниками CYR61. Его кратковременная активация с помощью PGF 2α in vivo предполагает возможную роль CYR61 в выживании эндотелиальных клеток и поддержании сосудистой сети во время раннего начала лютеолиза. Кроме того, лютеиновые стероидогенные и эндотелиальные клетки могут взаимодействовать таким образом, что стимулированный PGF 2α CYR61 из стероидогенных клеток снижает экспрессию ECE1 эндотелиальными клетками, что может играть роль в преходящем увеличении кровотока, наблюдаемом во время раннего начала лютеолиза. у коров.Высокая экспрессия CYR61 в развивающемся CL крупного рогатого скота на 4-й день подтверждает его роль в ангиогенезе, который сопровождает образование лютеина.
Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что CYR61 может быть основным регулятором ангиогенного переключения в течение жизни CL.
Мы выражаем особую благодарность сотрудникам Учебно-исследовательского центра Fairchild Dairy Университета Нью-Гэмпшира и Центра молочных продуктов Krauss в Центре сельскохозяйственных исследований и разработок штата Огайо за их квалифицированную помощь и поддержку в этой работе.
Augustin
HG
,Braun
K
,K
,Telemenakis
I
,Modlich
U
,KUHN
W
.Ангиогенез яичников. Фенотипическая характеристика эндотелиальных клеток в физиологической модели роста и регрессии кровеносных сосудов
.Ам Дж. Патол
1995
;147
:339
–351
.2.Reynolds
LP
,Грацуль-Бильска
AT
,Редмер
DA
.
Ангиогенез в желтом теле
.Эндокринный
2000
;12
:1
–9
.3.Чжан
Б
,Ян
Л
,Цанг
ПК
,Моисей
МА
.Экспрессия и регуляция матричной металлопротеиназы-2 (ММР-2) фактором некроза опухоли α (TNFα) в желтом теле крупного рогатого скота
.Мол Репрод Дев
2005
;70
:122
–132
.4.Мердок
WJ
,Gottsch
ML
.Протеолитические механизмы овуляторной фолликуло-лютеиновой трансформации
.Connect Tissue Res
2003
;44
:50
–57
.5.Педерсон
E
.Гистогенез лютеиновой ткани крысы-альбиноса
.Ам Дж Анат
1951
;88
:397
–427
.6.Парри
DM
,Willcox
DL
,Thorburn
GD
.Ультраструктурное и цитохимическое исследование желтого тела крупного рогатого скота
.
J Reprod Fertil
1980
;60
:349
–357
.7.Кавендер
JL
,Мердок
WJ
.Морфологические исследования микроциркуляторной системы периовуляторных фолликулов овец
.Биол Репрод
1988
;39
:989
–997
.8.Wiltbank
MC
,Dysko
RC
,Gallagher
KP
,Keyes
PL
Связь между кровотоком и стероидогенезом в желтом теле кролика
.J Reprod Fertil
1988
;84
:513
–520
.9.Fang
J
,Switch
Y
,Wiederschain
D
,Ян
L
,
Butterfield
C
,Jackson
G
,Harper
J
,Тамвакопулос
G
,Моисей
MA
.Матриксная металлопротеиназа-2 необходима для переключения на ангиогенный фенотип в модели опухоли
.
Proc Natl Acad Sci USA
2000
;97
:3884
–3889
.10.Bergers
G
,Brekken
R
,MCMAHON
G
,VU
G
,
,
ITOH
T
,
Tamaki
K
,Tanzawa
K
,Торп
P
,Итохара
S
,Верб
Z
,Ханахан
D
.Матриксная металлопротеиназа-9 запускает ангиогенное переключение во время канцерогенеза
.Nat Cell Biol
2000
;2
:737
–744
.11.Дхармараджан
AM
,Брюс
СЗ
,Мейер
GT
.Количественные ультраструктурные характеристики транспорта между цитоплазмой лютеиновых клеток и кровью в желтом теле беременной крысы
.Ам Дж Анат
1985
;172
:87
–99
.12.Яблонка-Шариф
A
,Грацуль-Бильска
AT
,Редмер
DA
,Рейнольдс
900Рост и пролиферация клеток желтого тела овец на протяжении эстрального цикла
.
Эндокринология
1993
;133
:1871
–1879
.13.Смит
MF
,McIntush
EW
,Смит
GW
.Механизмы, связанные с развитием желтого тела
.J Anim Sci
1994
;72
:1857
–1872
.14.Чжэн
J
,Редмер
DA
,Рейнольдс
LP
.Развитие сосудов и связывающие гепарин факторы роста в желтом теле крупного рогатого скота на нескольких стадиях эстрального цикла
.Биол Репрод
1993
;49
:1177
–1189
.15.Дункан
Туалет
.Желтое тело человека: ремоделирование во время лютеолиза и распознавание беременности матерью
.Изм. Изд.
2000
;5
:12
–17
.16.McCracken
JA
,Custer
EE
,Lamsa
JC
.Лютеолиз: нейроэндокринно-опосредованное событие
.
Physiol Rev
1999
;79
:263
–323
.17.Дэвис
JS
,Руэда
BR
,Спанел-Боровски
К
.Эндотелиальные клетки микрососудов желтого тела
.Репрод Биол Эндокринол
2003
;1
:89.
18.Fraser
HM
,Wulff
C
.Ангиогенез в желтом теле
.Репрод Биол Эндокринол
2003
;1
:88.
:88.
19.Чжан
B
,Ян
л
,MOSES
MA
,TSANG
PC
.Матричная металлопротеиназа мембранного типа 1 крупного рогатого скота: молекулярное клонирование и экспрессия в желтом теле
.Биол Репрод
2002
;67
:99
–106
.20.Чжан
Б
,Моисей
МА
,Цанг
ПК
.Временная и пространственная экспрессия тканевых ингибиторов металлопротеиназ 1 и 2 (ТИМП-1 и -2) в желтом теле крупного рогатого скота
.
Репрод Биол Эндокринол
2003
;1
:85.
21.Ян
Z
,Z
,Weich
Ha
,Bernart
W
,Breckwoldt
M
,Neulen
J
.Экспрессия матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в лютеинизированных клетках гранулезы человека in vitro
.J Clin Endocrinol Metab
1993
;77
:1723
–1725
.22.Yamamoto
S
,S
,Konishi
I
,Tsuruta
Y
,NANBU
K
,
MANDAI
K
M
,
Kuroda
H
,Matsushita
K
,Хамид
АА
,Юра
Y
,Мори
Т
.Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) во время фолликулогенеза и образования желтого тела в яичнике человека
.Гинекол Эндокринол
1997
;11
:371
–381
.
23.Laitinen
M
,Ristimaki
A
,A
,HONKASALO
M
,Narko
K
,
Paavonen
K
,Ritvos
O
.Дифференциальная гормональная регуляция уровней факторов роста эндотелия сосудов VEGF, VEGF-B и VEGF-C в культивируемых гранулезо-лютеиновых клетках человека
.Эндокринология
1997
;138
:4748
–4756
.24.Гева
Е
,Джаффе
РБ
.Роль фактора роста эндотелия сосудов в физиологии и патологии яичников
.Fertil Steril
2000
;74
:429
–438
.25.GOSPODAROWICZ
D
,CHENG
J
,LUI
GM
,
Baird
A
,
ESCH
F
,Bohlen
P
.Ангиогенный фактор желтого тела связан с фактором роста фибробластов
.Эндокринология
1985
;117
:2383
–2391
.
26.Fraser
HM
,Bell
J
,
J
,Wilson
H
,Taylor
PD
,
MORGAN
K
,Anderson
RA
,Duncan
WC
.Локализация и количественная оценка циклических изменений экспрессии фактора роста эндотелия сосудов эндокринных желез в желтом теле человека
.J Clin Endocrinol Metab
2005
;90
:427
–434
.27.Maisonpierre
Maisonpierre
PC
,SURI
C
,
JONES
PF
,Bartunkova
S
,Wiegand
S
SJ
,Radziejewski
C
,Compton
D
,MCCLAIN
J
,J
,ALDRICH
TH
,PAPADOPOULOS
N
,DALY
TJ
,Davis
S
et al..Ангиопоэтин-2, природный антагонист Tie2, нарушающий ангиогенез in vivo
.Наука
1997
;277
:55
–60
.
28.Berisha
B
,B
,SCHAMS
D
,KOSMANN
M
,AMSLGRUBER
W
,Einspanier
R
.Экспрессия и тканевая концентрация фактора роста эндотелия сосудов, его рецепторов и локализация в желтом теле крупного рогатого скота во время эстрального цикла и беременности
.Биол Репрод
2000
;63
:1106
–1114
.29.Пербал
Б
.Белки CCN: многофункциональные регуляторы передачи сигналов
.Ланцет
2004
;363
:62
–64
.30.Лау
LF
,Лам
SC
.Семейство регуляторов ангиогенеза CCN: соединение интегрина
.Exp Cell Res
1999
;248
:44
–57
.31.Wandji
SA
,Gadsby
JE
,Barber
JA
,Hammond
JM 90.
Рибонуклеиновые кислоты-мессенджеры для MAC25 и фактора роста соединительной ткани (CTGF) обратно регулируются во время фолликулогенеза и раннего лютеогенеза
.
Эндокринология
2000
;141
:2648
–2657
.32.Голдберг
MJ
,Моисей
МА
,Цанг
ПК
.Идентификация матричных металлопротеиназ и ингибиторов металлопротеиназ в желтых телах крупного рогатого скота и их изменение во время эстрального цикла
.J Anim Sci
1996
;74
:849
–857
.33.Пушка
MJ
,Паштет
JL
.Экспрессия и регуляция интерферон-гамма-индуцируемых протеасомных субъединиц LMP7 и LMP10 в желтом теле крупного рогатого скота
.Биол Репрод
2003
;68
:1447
–1454
.34.Паштет
JL
,Кондон
WA
.Влияние сыворотки и липопротеинов на стероидогенез в культуре бычьих лютеиновых клеток
.Mol Cell Endocrinol
1982
;28
:551
–562
.35.Пру
Дж.
К.
Линч
МП
,Дэвис
Дж.С.
Сигнальные механизмы при индуцированной фактором некроза опухоли α гибели микрососудистых эндотелиальных клеток желтого тела
.Репрод Биол Эндокринол
2003
;1
:17.
:17.
36.Gashaw
I
,STORER
S
,Boing
S
C
,Kimmig
R
,Winterhager
E
.Предменструальная регуляция проангиогенного фактора CYR61 в эндометрии человека
.Эндокринология
2008
;149
:2261
–2269
.37.GITTHER
OJ
,ARAUJO
RR
,PALHAO
MP
,RODRIGUES
BL
,BOM
MA
.Необходимость последовательных импульсов простагландина F2α для полного физиологического лютеолиза у крупного рогатого скота
.Биол Репрод
2009
;80
:641
–648
.38.
Невьян
TP
,Бериша
B
,Шамс
D
.Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста фибробластов (FGF) во время индуцированного лютеолиза в желтом теле крупного рогатого скота
.Мол Репрод Дев
2004
;67
:389
–395
.39.Колесникова
ТВ
,Лау
ЛФ
.Опосредованное CYR61 человека усиление bFGF-индуцированного синтеза ДНК в эндотелиальных клетках пупочной вены человека
.Онкоген
1998
;16
:747
–754
.40.Редмер
DA
,Грацуль
АТ
,Кирш
JD
,Рейнольдс
Ангиогенная активность желтых тел крупного рогатого скота на нескольких стадиях развития желтого тела
.J Reprod Fertil
1988
;82
:627
–634
.41.Beal
WE
,Milvae
RA
,Hansel
W
.
Продолжительность эстрального цикла и концентрации прогестерона в плазме после введения простагландина F-2α в начале эстрального цикла крупного рогатого скота
.J Reprod Fertil
1980
;59
:393
–396
.42.Inskeep
EK
.Возможное использование простагландинов для регулирования репродуктивных циклов домашних животных
.J Anim Sci
1973
;36
:1149
–1157
.43.Shirasuna
K
,K
,Sasahara
K
,K
,Matsui
M
,Shimizu
T
,Miyamoto
A
.Простагландин F2α по-разному влияет на экспрессию мРНК, связанную с ангиогенезом, вазоактивацией и простагландинами в раннем и среднем желтом теле коровы
.J Reprod Dev
2010
;56
:428
–436
.44.Цай
SJ
,Уилтбанк
MC
.Простагландин F2α регулирует определенные физиологические изменения в желтом теле крупного рогатого скота в начале и середине цикла
.
Биол Репрод
1998
;58
:346
–352
.45.Миямото
А
,фон Лутцов
Х
,Шамс
D
.Острые эффекты простагландинов F2α, E2 и I2 в подвергнутом микродиализу желтом теле крупного рогатого скота in vitro
.Биол Репрод
1993
;49
:423
–430
.46.Okuda
K
,K
,Uenoyama
Y
,Lee
кВт
,Sakumoto
R
,Skarzynski
D
.Стимуляция прогестерона простагландином F2α включает путь протеинкиназы С в культивируемых бычьих лютеиновых клетках
.J Reprod Dev
1998
;44
:79
–84
.47.Silva
PJ
,Juengel
JL
,Rollyson
MK
,Niswender
GD
Метаболизм простагландинов в желтом теле овец: катаболизм простагландина F2α (PGF2α) совпадает с резистентностью желтого тела к PGF2α
.
Биол Репрод
2000
;63
:1229
–1236
.48.CAVICCHIO
VA
,PRU
JK
,JK
,Davis
BS
,Davis
JS
,Rueda
BR
,Townson
DH
.Секреция моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 эндотелиальными клетками желтого тела крупного рогатого скота: регуляция цитокинами, но не простагландином F2α
.Эндокринология
2002
;143
:3582
–3589
.49.Андерсон
LE
,Ву
YL
,Цай
SJ
,Wiltbank
MC
Рецептор простагландина F2α в желтом теле: последняя информация о гене, информационной рибонуклеиновой кислоте и белке
.Биол Репрод
2001
;64
:1041
–1047
.50.MAMLUK
R
,CHEN
D
,D
,Greber
Y
,Davis
JS
,Meidan
R
.
Характеристика экспрессии матричной рибонуклеиновой кислоты для рецепторов простагландина F2α и лютеинизирующего гормона в различных типах лютеиновых клеток крупного рогатого скота
.Биол Репрод
1998
;58
:849
–856
.51.Meidan
R
,R
,LEVY
N
,KISLIOUK
T
,Podlovny
L
,Rusiansky
M
,Klipper
E
.Инь и Ян эндотелиальных клеток желтого тела: баланс между жизнью и смертью
.Домест Аним Эндокринол
2005
;29
:318
–328
.52.Спанель-Боровски
К
,Ван дер Бош
J
.Различные фенотипы культивируемых эндотелиальных клеток микрососудов, полученных из бычьего желтого тела. Исследование с помощью световой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)
.Резистентность клеточной ткани
1990
;261
:35
–47
.
53.Таунсон
Д
.Взаимодействия иммунных клеток и эндотелиальных клеток в желтом теле крупного рогатого скота
.Интегративная и сравнительная биология
2006
;46
:1055
–1059
.54.Liptak
AR
,Sullivan
BT
,BT
,,
Le
,Wijayagunawardane
MP
,Miyamoto
A
,Davis
JS
,Rueda
BR
,Таунсон
ДХ
.Совместная экспрессия моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 в желтом теле крупного рогатого скота: свидетельство взаимодействия иммунных и эндотелиальных клеток в системе совместного культивирования
.Биол Репрод
2005
;72
:1169
–1176
.55.INOUE
A
,A
,M
,
M
,Kimura
S
,
Kasuya
Y
,Miyauchi
T
,GOTO
K
,Masaki
T
.
Семейство эндотелинов человека: три структурно и фармакологически различных изопептида, предсказанных тремя отдельными генами
.Proc Natl Acad Sci USA
1989
;86
:2863
–2867
.56.Опгенорт
TJ
,Ву-Вонг
JR
,Шиосаки
К
.Эндотелинпревращающие ферменты
.FASEB J
1992
;6
:2653
–2659
.57.Girsh
E
,Wang
W
,MAMLUK
R
,Arditi
F
,
Friedman
A
,
Milvae
RA
,Meidan
R
.Регуляция экспрессии эндотелина-1 в желтом теле крупного рогатого скота: повышение простагландином F 2α
.Эндокринология
1996
;137
:5191
–5196
.58.Wright
MF
,Sayre
B
,Inskeep
EK
,Flores
JA
Простагландин F2α регуляция эндотелиновой системы желтого тела крупного рогатого скота в течение ранней и средней лютеиновой фазы
.
Биол Репрод
2001
;65
:1710
–1717
.59.levy
N
,N
,Gordin
M
,
MAMLUK
R
,Yanagisawa
M
,SMITH
M
MF
,Hampton
JH
,Meidan
R
.Различная клеточная локализация и регуляция экспрессии эндотелина-1 и эндотелинпревращающего фермента-1 в желтом теле крупного рогатого скота: значение для лютеолиза
.Эндокринология
2001
;142
:5254
–5260
.60.Акоста
TJ
,Йошизава
Н
,Охтани
М
,Миямото
А
Местные изменения кровотока в желтом теле в начале и середине цикла после инъекции простагландина F2α корове
.Биол Репрод
2002
;66
:651
–658
.61.MO
MO
FE
,MUNTEAN
AG
,CHEN
CC
,STOLZ
дБ
,WATKINS
SC
,LAU
LF
.
CYR61 (CCN1) необходим для развития плаценты и целостности сосудов
.Мол Селл Биол
2002
;22
:8709
–8720
.62.Киреева
МЛ
,Мо
ФЭ
,Ян
ГП
,Лау
ЛФ
CYR61, продукт индуцируемого фактором роста гена немедленного раннего развития, способствует клеточной пролиферации, миграции и адгезии
.Мол Селл Биол
1996
;16
:1326
–1334
.63.Киреева
МЛ
,Лам
СК
,Лау
ЛФ
.Адгезия эндотелиальных клеток пупочной вены человека к непосредственно раннему продукту гена Cyr61 опосредуется через интегрин αvβ3
.J Biol Chem
1998
;273
:3090
–3096
.64.Бабич
АМ
,Киреева
МЛ
,Колесникова
ТВ
,Лау
ЛФ
CYR61, продукт гена немедленного раннего развития, индуцируемого фактором роста, способствует ангиогенезу и росту опухоли
.
Proc Natl Acad Sci USA
1998
;95
:6355
–6360
.65.Fataccioli
V
,V
,,
V
,,
L
,NEUVILLE
P
,SPITZ
E
,
Adnot
S
,Calenda
V
,Тейгер
E
.Стимуляция ангиогенеза геном CYR61: новый терапевтический кандидат
.Hum Gene Ther
2002
;13
:1461
–1470
.66.TSAI
MS
,BOGART
DF
,CASTANEDA
JM
,LI
P
,LUPU
R
.CYR61 способствует онкогенезу молочной железы и прогрессированию рака
.Онкоген
2002
;21
:8178
–8185
.67.Чен
CC
,Мо
FE
,Лау
LF
.Ангиогенный фактор CYR61 активирует генетическую программу заживления ран в фибробластах кожи человека
.
J Biol Chem
2001
;276
:47329
–47337
.68.Абэ
М
,Сато
Y
.Микроматричный анализ кДНК профиля экспрессии генов в эндотелиальных клетках пупочной вены человека, активированных VEGF
.Ангиогенез
2001
;4
:289
–298
.69.Tsang
PC
,Poff
JP
,Boulton
EP
,Condon
3 WA
.
Желтое тело крупного рогатого скота четырехдневного возраста: продукция прогестерона и определение активности матриксной металлопротеиназы in vitro
.Биол Репрод
1995
;53
:1160
–1168
.© 2011 Общество изучения репродукции, Inc.
Одной из основных проблем, с которой обычно сталкиваются владельцы собак, является определение того, находится ли у их собаки течка.
Эта статья проливает свет на некоторые распространенные симптомы течки у собак и изменения их поведения при этом.
Течка или эстральный цикл — это период половой восприимчивости у самок собак. Возраст и продолжительность начала течки у собаки зависят от ее размера и породы. Обычно цикл течки происходит в возрасте 6-12 месяцев.У мелких пород это может быть уже в 5 месяцев, тогда как у более крупных пород цикл может не начинаться, пока собаке не исполнится 14 месяцев, а иногда даже позже. Цикл обычно происходит два раза в год, а продолжительность составляет примерно 3 недели. В этот период самка восприимчива к спариванию с кобелем и имеет высокие шансы забеременеть. Чтобы лучше понять признаки течки у собаки, ниже приведены различные стадии среднего 3-недельного цикла.
Как и у людей, эстральный цикл у собак имеет различные стадии, которые различаются по продолжительности и во время которых собака претерпевает различные поведенческие и физические изменения.
Этот цикл состоит из четырех стадий: проэструса, эструса, диэструса и анэструса.
Это первая стадия цикла течки, которая длится 7-10 дней. Ниже приведены симптомы этой стадии.
Начало эструса характеризует фертильную часть цикла течки у суки, когда яичники начинают выделять яйцеклетки для оплодотворения. Этот период длится от 5-7 дней, и симптомы включают следующее.
Когда начинается диэструс, фертильная часть цикла эструса у собак подходит к концу, и суки менее восприимчивы к кобелям.
Это период покоя, который длится 5-6 месяцев, в течение которого сука не претерпевает гормональных изменений и готовится к следующей течке.
Во время течки умеренные упражнения, короткие прогулки или небольшие периоды спокойной игры могут поддерживать активность собаки, поскольку для ее здоровья не рекомендуются ни чрезмерный отдых, ни интенсивные физические нагрузки. Знание вышеизложенного поможет вам понять поведение собак в период течки, а также необходимые меры и заботу, которые вам необходимо предпринять в эти дни для вашего питомца.
Ваш ветеринарный врач обсудит с вами возможность разрешить ложной беременности идти своим чередом; обычно признаки исчезают сами по себе.
Что касается игрушек, которые она добавила в свою коллекцию, то лучше позволить ей оставить их себе, чем усиливать ее тревогу, забирая их у нее. Одна вещь, которую вы можете сделать, — это немного изменить ее распорядок, брать ее на прогулки и увеличивать расстояние, когда она перестанет беспокоится о своем желании вернуться домой к своим «малышам».«Лучше игнорировать ее поведение; чем больше вы показываете ей, что беспокоитесь о том, что она делает, тем больше она может нервничать. В конце концов, она вернется к нормальной жизни.
В случае ложной беременности помните, что ваша собака следует своим материнским инстинктам, и это действительно невозможно контролировать. Такое поведение может исчезнуть примерно через три недели, но все собаки уникальны, и некоторые могут сохранять такое поведение дольше месяца или около того. Если ее поведение продолжается в течение длительного времени, около восьми недель или дольше, вам следует снова проконсультироваться с ветеринаром.
Ветеринар может провести ее осмотр и, если необходимо, вмешаться с помощью медицинских процедур, чтобы она перестала чувствовать себя так беспокойно. Ветеринар может дать ей что-нибудь, чтобы остановить выработку молока, или дать другие рекомендации, чтобы помочь избавиться от симптомов. Также она захочет проверить наличие других заболеваний; например, гипотиреоз может продлить симптомы ложной беременности.
Если ложная беременность проходит сама по себе, но возвращается снова и снова, вы можете обсудить с ветеринаром овариогистерэктомию или стерилизацию, чтобы облегчить состояние вашего пушистого члена семьи.Также доступны лекарства, но вы должны обсудить последствия длительного использования с вашим ветеринарным опекуном.
Предположение, что отсутствие эструса и проявлений овуляции специфично для человека, породило различные предположения о роли давления отбора в эволюции этих признаков в форме полового отбора или других поведенческих адаптаций.
Однако анализ сексуального поведения нечеловеческих приматов и людей показывает, что постоянная восприимчивость не уникальна для человека и что сексуальное поведение человека не является независимым от фаз менструального цикла. Количественные различия в распределении сексуального поведения между людьми и рассматриваемыми нечеловекообразными приматами могут быть результатом многих морфологических, экологических и культурных факторов, побочными эффектами которых являются эти различия. В случае предполагаемого давления отбора на исчезновение визуальных проявлений овуляции довольно маловероятная модель аногенитального набухания у шимпанзе у ранних гоминид может быть заменена раннегоминоидной моделью, в которой набухание было относительно небольшим.Ее снижение в антропогенезе могло быть вызвано двуногой локомоцией, ценой накопления воды, гиперемией участка, увеличением жировой ткани. Кроме того, обонятельная коммуникация в контексте полового поведения в климатических условиях африканской саванны была бы достаточна для выявления фертильных периодов менструального цикла.
Таким образом, предположение о существовании прямого давления отбора на половое поведение в плио/плейстоценовой эволюции Homininae кажется необоснованным.
Текущие выпуски теперь доступны на веб-сайте Chicago Journals. Прочтите последний выпуск. Current Anthropology — транснациональный журнал, посвященный исследованиям человечества, охватывающий весь спектр антропологических исследований человеческих культур, человека и других видов приматов. Общаясь между подобластями, журнал представляет статьи в самых разных областях, включая социальную, культурную и физическую антропологию, а также этнологию и этноисторию, археологию и предысторию, фольклор и лингвистику.
Информация об издателе С момента своего основания в 1890 году в качестве одного из трех основных подразделений Чикагского университета издательство University of Chicago Press взяло на себя обязательство распространять научные знания самого высокого уровня и публиковать серьезные работы, которые способствуют образованию, способствуют общественному пониманию.
и обогатить культурную жизнь. Сегодня Отдел журналов издает более 70 журналов и периодических изданий в твердом переплете по широкому кругу академических дисциплин, включая социальные науки, гуманитарные науки, образование, биологические и медицинские науки, а также физические науки.
Этот предмет является частью коллекции JSTOR.
Условия использования см. в наших Условиях использования
© 1999 г., Фонд антропологических исследований Веннера-Грена. Все права защищены
Запросить разрешения
Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J. Генетический фон этих мышей сохраняется на C57BL/6J. 1,5 Mb Мышей Dp/+ и 15q dupΔNdn получали, как описано ниже, и поддерживали на C57BL/6J. Для экспериментов по внутриутробной электропорации были приобретены рожавшие беременные самки мышей (E15.5, C57BL/6J или ICR; SLC, Сидзуока, Япония).Мышей содержали в комнате с 12-часовым циклом свет/темнота (свет включается в 8:00 и выключается в 20:00 в Университете Хиросимы и RIKEN; свет в 6:00 и выключается в 18:00 в Университете Кобе). и обеспечен свободный доступ к воде и пище. В помещениях для размножения поддерживали температуру 22–28 °C и влажность 50–60%. Все протоколы экспериментов на животных были одобрены комитетами по уходу и использованию животных Университета Хиросимы, RIKEN BSI, Медицинской школы Японии и Высшей школы медицины Университета Кобе и выполнялись в соответствии с установленными правилами и правилами. Мыши с дупликацией 1,5 Mb были созданы с помощью in vivo Cre -опосредованной рекомбинации в трансгенных мышах с Hprt-Cre согласно предыдущим отчетам 22 Вкратце, мыши, имеющие последовательность loxP, созданную случайным введением транспозона, были предоставлены базой данных TRACER (SB-205515 и SB-197365) 59 .
Геномная позиция интегрированного сайта составляла 58 999 433 для линии SB-197365 и 60 474 596 для линии SB-205515 соответственно (GRCm38/мм10).Этих мышей скрещивали с мышами Hprt-Cre (поддерживали на C57BL/6J) 22 . Из 105 животных, подвергнутых скринингу с помощью обычной геномной ПЦР, было получено 2 Dp/+ животных. Последовательности праймеров доступны в дополнительной таблице 1.
Геномная ДНК была выделена из хвоста мыши с помощью расщепления протеиназой K/SDS. Очищенную ДНК (10 мкг) расщепляли с помощью BsrGI для мышей 1,5 Mb Dp/+ и EcoRI для мышей 15q dupΔNdn соответственно.Расщепленную ДНК подвергали электрофорезу на 0,8% агарозном геле и переносили на мембрану Hybond-N + (GE Healthcare UK Ltd., Бакингемшир, Великобритания). Мембрану гибридизовали с меченым дигоксигенином ДНК-зондом, созданным с помощью набора PCR DIG Probe Synthesis Kit (Merck KGaA, Дармштадт, Германия). Для мышей 1,5 Mb Dp/+ ДНК-зонд был сконструирован как фрагмент длиной 560 пар оснований между генами Ube3a и Atp10a , в результате чего была получена полоса WT: 6,6 Kb, полоса Dp:.
8 Кб. Для мышей 15q dupΔNdn ДНК-зонд был сконструирован как фрагмент длиной 253 п.н., находящийся в 10 кб выше по течению от гена Ndn , в результате чего полоса WT: 12,3 кб, полоса Dp: 14,8 кб. Затем мембрану промывали буфером низкой жесткости (2 × SSC, 0,1% SDS), а затем буфером высокой жесткости (0,5 × SSC, 0,1% SDS) при 65 °C, затем блокировали блокирующим раствором (Merck KGaA) и инкубировали. с анти-DIG-AP Fab (разведение 1:10000; кат. 110910, Merck KGaA). Наконец, иммунореактивный сигнал был обнаружен с помощью хемилюминесцентной системы обнаружения (Merck KGaA).
aCGH выполняли в соответствии с протоколом производителя (набор микрочипов SurePrint G3 Mouse CGH, 1 ×1 M, #G4838A, Agilent Technologies, Inc., Санта-Клара, Калифорния, США) и предыдущим исследованием 56 . ДНК самца мыши WT (C57BL/6J) использовали в качестве эталонной геномной ДНК (mm9). Извлеченные сигналы затем анализировали в среде R с помощью пакетов DNAcopy, Gviz и GenomicRanges.
Количественная ОТ-ПЦР была проведена, как описано ранее, с небольшими изменениями 56 .Тотальные РНК в тканях головного мозга или первичных нейронах экстрагировали с помощью набора для выделения тотальной РНК SV (Promega Corporation., Мэдисон, Висконсин, США) или реагента TRIZOL (Thermo Fisher Scientific) и подвергали обратной транскрипции с помощью SuperScript II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, США). Массачусетс, США). В качестве внутреннего контроля использовали ген Gapdh . Последовательности праймеров показаны в дополнительной таблице 1.
Все щенки из одного помета оставались с матерью до отъема или, по крайней мере, до 21-го дня после рождения (P21).Затем 2–5 мышей содержали вместе с однопометниками-самцами. В поведенческом анализе использовали только мышей-самцов. Мышей разделили на две когорты.
В первой когорте ( N = 18 для каждого генотипа) был проведен тест реципрокного социального взаимодействия, а во второй группе ( N = 18 для каждого генотипа) – тест открытого поля и лабиринт Барнса. Все поведенческие тесты проводились с 09:00 до 18:00 во время световой фазы циркадного цикла. Все поведенческие тесты проводились в возрасте 8–17 недель.Мышей приучали к тестовой комнате не менее чем за 30 минут до начала поведенческих тестов.
Тест в открытом поле был проведен, как описано в предыдущем исследовании с небольшими изменениями 13 . Сначала испытуемую мышь помещали в угол аппарата открытого поля (50 × 50 × 50 см) при освещении 100 люкс. Двигательную активность и продолжительность пребывания в центральной части поля (36%) измеряли в течение 2 часов. Данные были собраны и проанализированы с использованием Image with Time OFCR4 (О’Хара, Токио, Япония).Отношение расстояния в центральной области к общему расстоянию («индекс тревожности») за 30 минут можно использовать в качестве показателя реакций, связанных с тревогой 24,25 .
Двух мышей с одинаковым генотипом и полом, содержащих в разных клетках (незнакомых мышей), помещали на арену открытого поля (50 × 50 × 50 см) с приглушенным светом (10 лк) и давали им двигаться свободно в течение 10 мин. Эти две мыши имели идентичный генотип, а также были одного возраста, пола и массы тела.В этом тесте в качестве образца использовалась пара мышей. Изображения снимались со скоростью два изображения в секунду с помощью ПЗС-камеры, расположенной над полем, и измерялось время социального взаимодействия.
Способности к пространственному и обратному обучению оценивались с использованием лабиринта Барнса, как описано в предыдущем исследовании 8 . Круглое поле (диаметром 100 см) с 12 отверстиями (диаметром 4 см) было приподнято на 100 см от пола. Поле было освещено более чем в 1000 люкс.Под одним из отверстий находился черный спасательный ящик из плексигласа (17 × 13 × 7 см) с подстилкой на основании.
Отверстие над ящиком для побега представляло собой цель. Местоположение мишени было одинаковым для данной мыши, но рандомизированным среди мышей. Перед каждым испытанием лабиринт поворачивали, при этом пространственное расположение мишени не менялось по отношению к отдаленным зрительным сигналам комнаты, чтобы предотвратить предвзятость, основанную на обонятельных или ближайших сигналах внутри лабиринта. Три испытания в день проводились шесть дней подряд.На 7-й день было проведено испытание зонда без ящика для побега, чтобы подтвердить, что эта пространственная задача была получена на основе навигации по сигналам удаленной окружающей среды. Для задачи обращения целевое местоположение для каждой мыши было смещено на полностью противоположную сторону круглой поверхности. Также проводилось такое же количество испытаний в день, но в течение 4 дней и проводилось пробное испытание. Время, проведенное вокруг каждой лунки, регистрировалось с помощью программного обеспечения для автоматического отслеживания (TimeBCM, O’hara).
Все мыши 1,5 Mb matDp/+ и его контрольные мыши WT для анализа поведения были получены путем оплодотворения in vitro. После отъема (в возрасте 3 недель) 2–5 мышей содержали вместе с однопометниками. Всего для поведенческих тестов использовали 17 WT (восемь самцов и 9 самок) и 14 1.5 Mb matDp/+ (7 самцов и 7 самок). Все поведенческие тесты проводились с 09:00 до 18:00.00 ч во время светлой фазы суточного цикла. Все поведенческие тесты проводились в возрасте от 11 до 17 недель. Мышей приучали к тестовой комнате не менее чем за 30 минут до начала поведенческих тестов. Поведенческий порядок и метод были такими же, как и при анализе мышей 1,5 Mb patDp/+ , описанных выше.
Плазмиды EGFP, управляемого промотором βActin (pβActin-EGFP), и его пустой вектор (pβActin-MCS) были подарены S.
Окабэ (Токийский университет). Для сверхэкспрессии Ndn конструкция pRC- Ndn была подарена K. Yoshikawa (Университет Осаки). Для других генов, включая Snrpn, Magel2 и Mkrn3 , продукт ПЦР, содержащий кодирующую область, субклонировали в pβActin-MCS. Форму NDN с N-концевой делецией (NDNΔN; AA110-325) получали с помощью обратной ПЦР и субклонировали в вектор pRC. DsRed субклонировали в pβActin-MCS (pβActin-DsRed). Все плазмиды очищали с помощью набора NucleoBond Xtra Midi (Takara Bio Inc., Сига, Япония) и подтверждены секвенированием ДНК.
Внутриутробная электропорация проводилась в соответствии с ранее описанным методом с небольшими изменениями 12 . Вкратце, беременных мышей E15.5 C57BL/6J или ICR (только для дополнительного рисунка 4) анестезировали ингаляцией изофлюрана (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Осака, Япония). Затем обнажали рога матки и с помощью стеклянной микропипетки вводили 1–2 мкл плазмид в одну сторону бокового желудочка мозга эмбриона.
Плазмиды разводили в буфере HBS (20% HEPES, 8% NaCl, 50 мМ KCl, 7 мМ Na 2 HPO 4 и 1 % глюкоза). Для сверхэкспрессии каждого гена 15q11-q13 плазмиды смешивали с pβActin-EGFP в соотношении 1:1 (конечная концентрация плазмид: 0,5 мкг/мкл). Для контроля использовали pβActin-EGFP и pβActin-DsRed в том же соотношении (0,5 мкг/мкл каждого). К смеси плазмид добавляли одну десятую часть 0,1% раствора Fast Green (Merck KGaA). Квадратные электронные импульсы (30 В в течение 50 мс, четыре раза с интервалом 950 мс) подавали с помощью электрода типа щипцов (CUY650P5; NEPAGENE, Чиба, Япония), подключенного к электропоратору (CUY21SC; NEPAGENE).Рога матки помещали обратно в брюшную полость. После операции температуру тела мышей поддерживали на уровне 37 °C, и мышей возвращали в домашнюю клетку.
Несовершеннолетних мышей использовали для визуализации in vivo через 3 недели после рождения. Для двухфотонной визуализации in vivo методы истонченного черепа были выполнены, как описано ранее, с небольшими изменениями 12 .
Мышей анестезировали ингаляцией изофлюрана во время операции и визуализации.Теменную кость обрезали вручную с помощью микрохирургических лезвий (Nordland Blade; Salvin Dental Specialities, Inc., Шарлотта, Северная Каролина, США) до тех пор, пока толщина черепа не достигала ~15 мкм. После операции мышей помещали под систему двухфотонного микроскопа (A1R MP+; Nikon, Токио, Япония) с импульсным лазером (Chameleon Vision II; Coherent, Inc., Санта-Клара, Калифорния, США) и иммерсионным объективом ×25. объектив (CFI75; Nikon, ApoLWD, числовая апертура (NA) 1,10). Сигнал флуоресценции GFP (для сверхэкспрессии плазмиды) или YFP (для мышей линии Thy1-YFP-H ) разделяли с помощью дихроичного зеркала (560 нм) и барьерного фильтра (575/25 нм).Целевой областью была соматосенсорная кора, расположенная в брегме — 1,0 мм и латеральнее 1,5–2,5 мм. Длина волны была установлена на 920 нм для получения флуоресцентных сигналов. Для получения изображений дендритных шипов размер изображения составлял 78 × 78 мкм, а размер шага был установлен на 0,425 мкм.
Размер отдельных изображений в пикселях составлял 512 × 512. Метод расчета скорости оборота позвоночника также был описан ранее 12 . После визуализации в день 0 скальп мышей зашивали, и мышей помещали обратно в их домашнюю клетку.На 2-й день скальп снова вскрыли и получили изображения того же положения дендритов. Изображения, полученные на 2-й день, использовали для расчета плотности позвоночника. Некоторых мышей исключили из анализа оборота позвоночника (т. е. скорости формирования и элиминации) и использовали только в анализе плотности, поскольку для анализа оборота позвоночника требовались высококачественные изображения.
Дендритные шипики были классифицированы в соответствии с предыдущими исследованиями 31 . Вкратце, дендритные шипы обычно делят на четыре категории: короткие, филоподии, тонкие и грибовидные.«Короткие» шипы не имели шейки и имели небольшой выступ; «Филоподия» не имела головы и имела длинный выступ; «Тонкий» имел длинную тонкую шею с маленькой головой; а «Гриб» имел тонкую шею с крупной головой, как у зрелой формы.
Шипы подсчитывали и классифицировали по этим четырем категориям для контрольной плазмиды или нейронов со сверхэкспрессией Ndn .
В этом анализе использовали мышей в возрасте 3 недель, которым вводили Ndn или контрольную плазмиду GFP посредством внутриутробной электропорации.Корональные срезы (толщиной 300 мкм), содержащие бочкообразное поле соматосенсорной коры (S1BF), готовили с помощью VT1200S (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) в ледяном растворе для резки (в мМ): 120 холин-Cl, 2 KCl, 8 MgCl 2 , 28 NaHCO 3 , 1,25 NaH 2 PO 4 и 20 барботаж глюкозы с 95% O 2 и 5% CO 2 Срезы инкубировали не менее 1 ч в искусственной спинномозговой жидкости (ИЦЖ) (в мМ): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2 , 1 MgSO 4 , 1.25 NaH 2 PO 4 , 26 NaHCO 3 и 20 глюкоза барботировали с 95% O2 и 5% CO2 при комнатной температуре.
Стеклянные пипетки заполняли внутриклеточным раствором (в мМ): 140 KD-глюконат, 8 KCl, 2 NaCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 3 Mg-ATP и 0,5 Na 2 -GTP, доведенный до pH 7,3 с помощью KOH. . Записи целых клеток были сделаны из сомата GFP-положительных пирамидальных нейронов в слое II/III S1BF при 32 ± 1 °C. GFP-положительные пирамидальные нейроны идентифицировали на основании треугольного вида клеточной сомы и наличия одного апикального дендрита с использованием вертикального микроскопа (BX50WI; Olympus, Токио, Япония) с испусканием светодиодного света с длиной волны 470 нм (SPECTRA; Lumencor). , Бивертон, штат Орегон, США).Потенциалы действия регистрировали при удерживающем потенциале -70 мВ с введением деполяризованного тока. Миниатюрные EPSC были зарегистрированы при удерживающем потенциале -80 мВ в присутствии 0,5 мкМ тетродотоксина и 10 мкМ бикукуллина. Ионные токи регистрировали с помощью патч-клеммы EPC10 USB (HEKA Elektronik, Lambrecht/Pfalz, Германия). Сигналы оцифровывались на частоте 20 кГц для записи вызванных ответов или на частоте 40 кГц для записи миниатюрных ответов.
Сбор данных в режиме онлайн и анализ данных в автономном режиме выполнялись с использованием программного обеспечения Patchmaster (V2x73.1, НЕКА Электроник). Миниатюрные ответы анализировали с помощью программы Mini Analysis (версия 6.0.7; Synaptosoft Inc., Декейтер, Джорджия, США). Анализ данных проводился слепым методом.
Срезы головного мозга для экспериментов получали от самцов мышей в возрасте 5-8 недель, описанных ранее 9 . Мышей глубоко анестезировали изофлураном (~ 4% в воздухе, об./об.). После декапитации мозг быстро удаляли и помещали в ледяной солевой раствор с дефицитом Na + (~4 °C), содержащий следующие соединения: 252 мМ сахарозы, 21 мМ NaHCO 3 , 3.35 мМ KCl, 0,5 мМ CaCl 2 , 6,0 мМ MgCl 2 , 0,6 мМ NaH 2 PO 4 и 10 мМ глюкозы. Каждый мозг разрезали на блоки и делали три или четыре коронарных среза (250 мкм) с помощью вибратома (VT1200s, Leica) по всей ростро-каудальной протяженности ядер дорсального шва (DRN) между -4,84 и -4,48 мм от брегма по атласу мозга мыши 60 .
Срезы помещали в погруженную камеру не менее чем на 1 час в ACSF, содержащем 138,6 мМ NaCl, 3.35 мМ KCL, 2 мм CaCl 2 , 1,3 мМ MGCL 2 , 21,0 мм NaHCO 3 , 0,6 мм Nah 2 PO 4 и 10,0 мм глюкоза. pH ACSF поддерживали на уровне 7,4 барботированием газа 95% O 2 /5% CO 2 . Отдельные срезы переносили в регистрационную камеру, прикрепленную к предметному столику микроскопа, и непрерывно перфузировали насыщенным кислородом ACSF со скоростью потока 1,4 мл/мин при температуре 29°C. Накладные электроды из боросиликатного стекла (World Precision Instruments, Сарасота, Флорида, США) использовались для записи целых клеток из клеток DRN с сопротивлением ~ 3 МОм при заполнении внутренним раствором 150 мМ метансульфоната калия, 1.0 мМ KCl, 0,2 мМ K-EGTA, 20 мМ HEPES, 3,0 мМ Mg-ATP 2 , 0,4 мМ Na-GTP и 15 мМ биоцитина (pH 7,38, ~ 295 мОсм). Серотонинергические клетки DRN визуально идентифицировали на ИК-ДИК-изображениях с использованием иммерсионного объектива с водой (×40, NA = 0,80; Olympus).
Записи пэтч-клэмп цельных клеток получали и контролировали с помощью усилителя Axon 700B Multiclamp (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения для сбора данных pClamp10 (Molecular Devices, Калифорния, США). Характеристики клеток, включая мембранный потенциал покоя и характеристики потенциала действия, измеряли в режиме фиксации тока.Для регистрации спонтанных возбуждающих синаптических токов (sEPSC) клетки зажимали по напряжению при -70 мВ. Серотонинергические нейроны были идентифицированы электрофизиологически по их формам потенциала действия, имеющим большую ширину на полувысоте (> 1,5 мс) и большую амплитуду выброса (> 30 мВ), как сообщалось ранее 9 . Все сигналы были отфильтрованы на частоте 2 кГц и оцифрованы на частоте 10–20 кГц. Полученные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения «clampfit11» (Molecular Devices), «Kyplot» (Kyence, Tokyo, Japan) и «Mini analysis version 6» (Synaptosoft, Decatur, GA, USA).
Последовательность направляющей РНК-мишени определяли с помощью инструмента CRISPR Design (http://crispr.
mit.edu/). Направляющую последовательность из 20 п.н. для проксимальной (sgNdnProx) и дистальной (sgNdnDist) областей Ndn клонировали в вектор pX330 (Addgene #42230). Целевыми последовательностями были 5′-CCATGTAGATGACCGAAGTT-3′ для sgNdnProx и 5′-GTGCTAGAGATAAGATTCGT-3′ для sgNdnDist. Схематическая диаграмма доступна на дополнительном рис.7а. В соответствии с протоколом производителя два вектора, экспрессирующих направляющую РНК (по 1 мкг каждый), трансфицировали в клеточную линию Neuro2a с помощью липофектоамина 3000 (Thermo Fisher Scientific). Геномную ДНК очищали, и целевую делецию подтверждали с помощью обычной ПЦР. Плазмиду GFP использовали в качестве отрицательного контроля. Последовательности праймеров доступны в дополнительной таблице 1.
), как описано в предыдущем исследовании 61 . Инъецированные эмбрионы реимплантировали псевдобеременным самкам ICR. Генотипирование ПЦР проводили с делетированными аллель-специфичными праймерами, как показано в дополнительной таблице 1. , Германия).ddPCR с системой EvaGreen проводили в соответствии с протоколами производителя (20 мкл реакций в виде следующих компонентов: 1x ddPCR SuperMix, 0,15 мкМ каждого праймера, 0,3 ед/мкл EcoRI-HF (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США), 1 нг/мкл геномной ДНК). Затем капли генерировали в генераторе капель QX200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Геркулес, Калифорния, США). Планшет запечатывали с помощью устройства для запайки планшетов PX1 PCR (Bio-Rad). Реакцию ПЦР проводили по следующему протоколу амплификации: 95 °C в течение 5 мин, затем 40 циклов: денатурация при 95 °C в течение 30 с; отжиг и удлинение при 63°C в течение 90 сек, затем инкубация при 4°C в течение 5 мин, затем при 90°C в течение 5 мин.Скорость линейного изменения была установлена на 2 °C/с.
Ампликон считывали с помощью устройства для считывания капель QX200 (Bio-Rad). В качестве внутреннего контроля использовали ген Htr1a . Последовательности праймеров доступны в дополнительной таблице 1. Иммуногистохимия для анализа VGAT/VGLUT проводилась, как сообщалось ранее, с некоторыми изменениями 9 . Мышей в возрасте 3 недель анестезировали и транскардиально перфузировали фосфатным буфером с последующим введением 4% параформальдегида в 0.1 М PBS. Мозг препарировали и погружали в тот же фиксатор при 4 °C на ночь. Корональные срезы (толщиной 50 мкм) готовили с помощью вибратома (VT1200S, Leica), затем хранили в 0,1 М PBS, содержащем 0,02% азида натрия, при 4°С. Срезы головного мозга обрабатывали 0,3% H 2 O 2 в PBS в течение 30 мин, трижды промывали PBS в течение 5 мин, инкубировали с блокирующим раствором (PBS, содержащий 3% нормальной козьей сыворотки и 0,3% Triton X-100). ) в течение 30 мин и инкубировали с первичными антителами, включая кроличьи поликлональные антитела против VGAT (разведение 1:1000; кат.
131 003, Synaptic Systems, Геттинген, Германия), мышиное моноклональное антитело против VGLUT1 (разведение 1:1000; кат. 135 311, Synaptic Systems), мышиное моноклональное антитело анти-GFP (разведение 1:200; кат. A-11120, Thermo Fisher Scientific) или кроличье антитело против некдина (разведение 1:200; NC243, Cosmo Bio Co., Ltd., Токио, Япония) при 4 °C в течение ночи. Срезы промывали четыре раза PBS, содержащим 0,3% Triton X-100 (PBST), по 10 мин каждый, инкубировали с флуоресцентно-конъюгированными вторичными антителами (Alexa Fluor 488, конъюгированными против мышиных IgG, Alexa Fluor 488, конъюгированными против кроличьих IgG или Alexa Fluor 488). Конъюгированный Fluor 568 антикроличий IgG, Thermo Fisher Scientific) в течение 1 часа, четыре раза промывали PBST по 10 минут каждый, переносили на предметное стекло и монтировали с помощью VECTASHEILD с DAPI (VECTOR Laboratories, Inc., Берлингейм, Калифорния, США). Для анализа VGAT/VGLUT (рис. 5f) изображения коркового слоя II/III S1BF были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа FV3000 (Olympus) с объективом ×60 (цифровой зум ×1,6).
Размер отдельных изображений в пикселях составлял 512 × 512. Для количественной оценки уровня экспрессии NDN (дополнительный рисунок 4) использовался тот же конфокальный микроскоп с объективом × 100 (цифровой зум × 1,5), а изображения с Z-стеком были получено с шагом 0,5 мкм (1024 × 1024 пикселя). Затем были получены изображения Z-проекции с максимальной интенсивностью.Наблюдая сигнал GFP и DAPI, вручную отбирали трансфицированные или нетрансфицированные ядра ( N = 20 для каждого). Среднюю интенсивность/пиксель NDN в ядре использовали для сравнения трансфицированных и нетрансфицированных клеток.
Для подсчета количества точек VGAT и VGLUT было получено шесть изображений от трех мышей каждого генотипа в S1BF (Bregma, от −1,34 до −1,82 мм). Затем были выбраны три области интереса (100 × 100 пикселей) из одного изображения и преобразованы в двоичные данные с заранее заданным порогом.Порог определялся проверкой линейности. Среднее число точек трех ROI определяли как биологический повтор.
Все анализы были выполнены с помощью программного обеспечения ImageJ.
Все поведенческие тесты проводились, как описано выше ( 1,5 Mb patDp/+ раздел поведения), за исключением следующего.
Самцов мышей подвергали следующим поведенческим тестам в следующем порядке: тест открытого поля, тест взаимного социального взаимодействия, тест трехкамерного социального взаимодействия, тест самцов USV, индуцированный самками, и тест лабиринта Барнса ( N = 18 для WT, 19 для 15q dupΔNdn ).Все поведенческие тесты были завершены в возрасте 11–23 недель, за исключением теста P7 USV.
Общительность оценивалась с помощью трехкамерного теста социального взаимодействия 37 . Размер каждой камеры составлял 20 ×40 ×22 см. Перегородки были сделаны из прозрачного плексигласа с небольшими квадратными отверстиями (5 × 3 см) для доступа в каждую камеру (О’Хара).
В одну из камер помещали незнакомую мышь (чужой; C57BL/6J), которая ранее не контактировала с исследуемой мышью.Незнакомая мышь была заключена в маленькую круглую проволочную клетку. Испытуемую мышь сначала помещали в среднюю камеру и давали акклиматизироваться в поле в течение 10 минут. Затем был проведен тест на общительность в течение 10 минут («Незнакомец против Пустоты»). Данные были собраны и проанализированы с использованием Time CSI (O’hara).
Регистрация USV, испускаемого щенками, была протестирована на 7-й день после рождения. Каждый щенок был изолирован от матери и помещен в пластиковый стакан с подстилкой.Немедленно стакан помещали в звукопоглощающую коробку и начинали запись с помощью микрофона с ультразвуковым обнаружением (Avisoft-Recorder USGH, v3.4, Multi, 10311, Avisoft Bioacoustics, Берлин, Германия). Микрофон располагался на 10 см выше дна поля. Время записи составляло 5 минут, а частота дискретизации была установлена на 300 кГц.
Щенков переводили в клетку для содержания после записи. После того, как все детеныши в клетке были зарегистрированы, их перевели в домашнюю клетку. Для акустического анализа данные были переданы в SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics) и подвергнуты быстрому преобразованию Фурье с последующей фильтрацией амплитуд ниже 30 кГц.Количество USV определяли с помощью SASLab Pro.
USV, излучаемый самцом мыши во время взаимодействия с самкой мыши, измеряли, как сообщалось ранее, с небольшими изменениями 38 . За два дня до тестирования каждого испытуемого самца мыши содержали со взрослой самкой мыши (C57BL/6J). На следующий день мышей-самцов переносили в новую клетку и содержали индивидуально в течение 1 дня. Рано утром в день испытаний определяли эстральный цикл самок мышей.Каждого испытуемого самца мыши переносили в комнату для тестирования и приучали к 30 минутам, после чего следовало 10 минутное привыкание к тестовому полю (цилиндр; диаметр 23 см, высота 27 см).
Поэтому самку мыши в состоянии течки переносили на поле для тестирования, и в течение 5 мин регистрировали ультразвуковую дозу. Микрофон располагался на 10 см выше основания поля. Время записи составляло 5 минут, а частота дискретизации была установлена на 300 кГц. Для акустического анализа данные были переданы в SASLab Pro и подвергнуты быстрому преобразованию Фурье, а затем отфильтрованы амплитуды ниже 30 кГц.Поскольку взрослые мыши генерируют много шума, который препятствует автоматическому анализу USV, эти шумы вручную опускали, а номер вызова измеряли вручную.
Содержание 5-HT и 5-HIAA в тканях головного мозга оценивали, как описано ранее 13 . Вкратце, каждую область мозга (FC: лобная кора, Hip: гиппокамп, Hyp: гипоталамус, Mid: средний мозг, CB: мозжечок, PoM: мост и продолговатый мозг) рассекали в ледяном сбалансированном солевом растворе Хэнкса.Гомогенаты тканей готовили путем гомогенизации (0,2 М хлорная кислота), депротеинизации (на льду в течение 30 мин) и центрифугирования (20 000 × г , в течение 15 мин при 0°С), фильтрации (0,45 мкм; Merck KGaA) и регулирования рН.
до 3,0 с 1 М ацетатом натрия. Супернатант использовали для анализа с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (HTEC-500, Eicom, Киото, Япония). Вес ткани использовали для нормализации каждого образца.
Концентрации L- и D-серина в тканях головного мозга измеряли методом ВЭЖХ. Фронтальную кору головного мозга рассекали и гомогенизировали в 0,2 М ледяной хлорной кислоте. Гомогенаты готовили так же, как описано выше. Затем L- и D-серин измеряли с помощью системы ВЭЖХ (HTEC-500; Eicom). Предколоночную дериватизацию проводили с использованием 4 мМ о-фталдиальдегида/N-ацетил-L-цистеина (pH 10,0) в системе автоматического ввода проб (M-500; Eicom) при 10 °C в течение 5 минут.Производные разделяли на октадецилсилановой колонке (EX-3ODS, φ 4,6 мм ×100 мм, Eicom) при 30°С с 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,0), содержащим 18% метанола. Система ВЭЖХ была настроена на приложенный потенциал +600 мВ по отношению к эталонному аналитическому электроду Ag/AgCl.
Количество серина определяли по площади пика с использованием PowerChrom (eDAQ, Новый Южный Уэльс, Австралия) с внешними стандартами. Значения нормализовали по массе ткани.
E16.Для получения первичной культуры нейронов использовали 5 беременных мышей 1,5 Mb patDp +. Эмбрионы удаляли хирургическим путем, а гиппокампы рассекали в ледяном сбалансированном солевом растворе Хэнка. Затем были подготовлены первичные нейроны гиппокампа с использованием системы культивирования нервных клеток SUMITOMO (Sumitomo Bakelite Co., Ltd). Подготовленные нейроны содержали в среде для посева нейронов, содержащей МЕМ, 5% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, 0,6% D-глюкозы, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО. 2 на 6 ч.Среда была заменена на среду для поддержания нейронов (добавка Neurobasal/NeuroBrew-21, 0,5 мМ L-глутамина) до проведения анализа.